猪抗沙门氏菌免疫应答研究进展

赵 歌，胡茂志*，葛浩杰，孟 闯，焦新安，潘志明*

(1.扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州 225009；2.扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009；3.扬州大学农业农村部农产品质量安全生物性危害因子(动物源)控制重点实验室，江苏扬州 225009；4.扬州大学农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏扬州 225009)

沙门氏菌(Salmonella)是一种重要的人兽共患病病原菌。流行病学研究表明，猪源的优势血清型有鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium,STM)和猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis,SCS)，它们污染的猪肉制品是引发人类沙门氏菌感染的主要来源[1]。沙门氏菌在吞噬细胞内的存活可诱发败血症，这不仅给养猪业造成巨大损失，而且严重影响人类健康。猪既可用于研究沙门氏菌的致病机制，也是疫苗研发的理想模型。据报道，在猪抗沙门氏菌感染免疫过程中，细胞免疫在清除病原体并维持稳态方面发挥重要作用[2]。因此，了解猪对沙门氏菌感染的免疫应答规律有助于沙门氏菌病的防控。本文综述了猪的免疫系统、沙门氏菌感染猪引起的天然免疫和获得性免疫应答，以期为抗沙门氏菌感染的免疫学研究提供参考。

1 猪的免疫系统

1.1 猪的免疫系统组成

猪免疫系统主要由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成，具有免疫防御和免疫调控作用。根据分化的早晚和功能不同，免疫器官可以分为中枢免疫器官和外周免疫器官。中枢免疫器官包括骨髓和胸腺。骨髓是典型的初级淋巴器官，是淋巴细胞发育的场所。胸腺位于胸骨后区，是研究淋巴细胞发育的良好模型，胸腺上皮细胞负责T淋巴细胞的增殖和分化。外周免疫器官是成熟淋巴细胞定居的场所，也是产生免疫应答的重要部位之一，包括淋巴结、脾脏、黏膜相关淋巴组织等。在机体组织中，体液通过传入淋巴管从组织输送到淋巴结。猪脾脏对过滤某些细菌(如肺炎球菌)至关重要，也是目前医学研究脾脏再生的极佳模型[3]。

免疫细胞在抗感染过程中发挥以下重要作用：①在天然免疫过程中，上皮细胞能够对各种病原体产生反应，分泌干扰素(interferon,IFN)和趋化性/炎性细胞因子，阻止病原体的复制并参与免疫细胞的募集和活化；②巨噬细胞(Macrophage,Mφ)可以呈递抗原和分泌炎性细胞因子。猪Mφ一般为CD172a+、CD1+/-、CD4-、CD11R1-、CD14+/-、CD16+、MHCⅡlow、CD80/86low[4]。另外，CD163也可以作为Mφ的标志[4]；③树突状细胞(dendritic cell,DC)分为浆细胞样DC(plasmacytiod DC,pDC)和经典DC(classical DC,cDC)。不同的DC亚型，其表型不同。猪血液中DC为CD13+和CD14-。淋巴组织中的DC、Mφ和B细胞的功能和表型存在重叠。④多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)是主要的天然吞噬细胞。据报道，猪链球菌2型可以激活猪PMN分泌IL-6和TNF-α等细胞因子[5]；⑤血液中自然杀伤(natural killer,NK)细胞约占总淋巴细胞的1%～24%。根据NKp46的表达，可以将猪NK细胞分为NKp46-、NKp46+和NKp46high3个亚群。猪NK细胞在防御病原体感染过程中发挥重要作用。如在猪异形孢子虫感染期间，NK细胞数量增加[6]。

1.2 与人类和小鼠的差异

与人类相比，猪的免疫系统在组织结构方面主要有3个特点：淋巴结倒置、两种类型的派伊尔氏结(Peyer's patches,PPs)，以及依赖妊娠母猪乳腺分泌物的被动免疫[7]。

与其他哺乳动物不同，猪淋巴结皮质和髓质呈现倒置分布。即皮质区可以出现在被膜和髓质之间的外周区域，也可以分布在髓质区内侧的中央区域[8]。

肠黏膜上皮和肠道相关淋巴组织(gut associated lymphatic tissue,GALT)是抵抗病原体的重要物理和免疫屏障，PPs是其重要的组分之一，沿回肠和空肠段分布，分为回肠PPs(ileum PPs,IPPs)和空肠PPs(jejunum PPs,JPPs)。人类IPPs和JPPs均为多个分离的滤泡结构，猪和反刍动物等的JPPs与人类相似，但IPPs则是沿着回肠的连续结构。JPPs和IPPs都是启动B 细胞和提供获得性免疫应答的主要场所，并与肠道微生物菌群密切接触，但二者在细胞数量、基因表达和与细胞免疫相关的受体调控等方面存在明显区别[9]。与JPPs相比，猪IPPs中的B细胞相对较多，而T细胞较少。据报道，猪IPPs和JPPs中的B细胞分别约占90%和45%，肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node,MLN)中的B细胞约占35%。另外，猪的IPPs和JPPs在免疫相关基因[10]和受体的表达方面也存在差异。这种差异可能与它们在小肠的位置不同有关。此外，GALT的转录组测序结果揭示，猪JPPs和IPPs之间的免疫组学存在差异，与JPPs相比，猪IPPs中T细胞活化信号下调，而B细胞受体(B cell receptor,BCR)信号上调。例如，IPPs中介导T细胞区形成的CCR7及其配体CCL21、募集IgA分泌型细胞(T细胞依赖型)的CCR10、调控T细胞活化的CTLA4的表达水平较低；参与初始CD4+T细胞分化的调控因子的表达水平较低；转录因子FOXP3(参与诱导Treg细胞的分化)、GATA3(参与Th2分化)、编码T-bet的STAT4和TBX21(参与Th1分化)以及编码Rorγt的RORC(参与Th17分化)等的表达水平较低，而BCL6(参与滤泡Th细胞的分化，促进B细胞产生抗体)高表达；ICOS(滤泡Th细胞的表面标志)、CCR7-CCL21(介导PPs滤泡的形成)、TNFSF11(参与GALT的发育)的表达水平较低。而JPPs中CCR9(促进IgA分泌的T细胞归巢到小肠)的表达水平较高。这些数据均支持可以用猪的血液替代组织来进行相关功能的研究[9]。

母源抗体可以为新生仔猪提供保护性被动免疫。人类是血绒膜胎盘，母体血液直接与胎儿绒毛膜接触，胎儿从而获得被动免疫。而猪是上皮绒膜胎盘，妊娠母猪体内的抗体不能穿过胎盘，新生仔猪主要通过初乳和乳汁等获得母源抗体。母源抗体的保护作用是由体液免疫、被动黏膜免疫和细胞免疫等诸多因素介导的[7]。

2 沙门氏菌诱导的天然免疫

天然免疫在抗肠道病原体和诱导获得性免疫应答方面至关重要，是机体抵抗病原微生物感染的重要屏障之一。

猪口服沙门氏菌后，细菌进入肠道，在扁桃体、MLN和PPs中分别引起不同的免疫反应。对机体而言，GALT包括PPs、MLN和散布在上皮细胞与固有层之间的淋巴细胞，在肠道局部免疫中扮演着重要角色。沙门氏菌可以逃避猪扁桃体的免疫防御作用，在其中复制和定殖，并进一步感染MLN和PPs。

机体的天然免疫主要是通过激活免疫相关受体、天然免疫细胞和分泌细胞因子实现的。在病原体第一次入侵时，猪上皮细胞通过模式识别受体(patern recognition receptor,PRR)识别病原体相关分子模式，分泌IFN和炎性细胞因子，阻止病原体的复制，并募集和活化免疫细胞。猪Mφs、PMNs、DCs和NKs受到募集并到达炎症部位，发挥细胞免疫功能。如STM感染24 h和48 h后，猪体内TLR2和TLR4的表达上调[11]。猪Mφs会产生吲哚胺2-3-二加氧酶(indoleamine 2-3-dioxygenase)，诱导产生促炎因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和 IL-12等，进一步抑制沙门氏菌的存活和增殖[12]。NKs细胞可杀死靶细胞，并产生细胞因子(如IFN-γ)来阻止病原体的传播。但过多的细胞因子也可能会引起败血症，从而破坏正常的细胞功能。研究表明，抗炎细胞因子和药物可抑制由沙门氏菌引起的过度炎症反应。如黄芪多糖可通过调节TLR4信号通路相关基因的表达以降低促炎因子IL-1β和TNF-α的分泌，减少机体免疫应激反应[13]。

免疫组织和免疫细胞表面的相关蛋白和受体也参与免疫调节，并抑制沙门氏菌存活。存在于黏膜组织中的CCL28蛋白和表面活性蛋白D对沙门氏菌具有抗菌活性，为肠道提供免疫保护[14]。TREM受体在中性粒细胞和单核细胞上表达。它可以诱导DCs表达炎性细胞因子和黏附分子，促进其成熟，参与免疫调节。据报道，猪口服感染STM 8 h和24 h后，其骨髓细胞TREM-1的表达上调[15]。

3 沙门氏菌诱导的获得性免疫

获得性免疫以高度专业化和系统化的组织方式为机体提供免疫保护。由于入侵的沙门氏菌可以通过免疫逃逸和表达毒力因子提高对宿主细胞杀菌作用的抵抗力。因此，通过启动获得性免疫应答，才能有效杀灭细菌。

3.1 T细胞的作用

在脊椎动物中，根据T细胞受体的类型，可以将T细胞分为αβT细胞和γδT细胞两个亚群。αβT细胞最终分化为CD4+T细胞和CD8+T细胞。这些细胞能够产生IFN-γ并在炎症部位介导保护性免疫应答。与家禽不同的是，猪具有大量的CD4+CD8+T细胞，其功能尚不完全清楚，据报道，此细胞群体具有部分记忆细胞的功能[16]。

当沙门氏菌被机体识别后，首先激活天然免疫，DCs和B细胞进一步发挥抗原呈递作用来刺激获得性免疫应答。CD4+T细胞和CD8+T细胞分别通过分泌细胞因子和发挥细胞毒活性杀死靶细胞。此外，与之相关的信号分子在抗沙门氏菌感染方面也发挥重要作用。研究表明，TLR信号接头髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88)促进T细胞增殖和Th1类的细胞分化[17]。在细菌被清除之前，CD4+T细胞对Ⅲ型分泌系统分泌的SseJ蛋白具有持续的免疫作用[18]。CD4+T细胞也与天然免疫有关，可与中性粒细胞协同作用，因而可以轻度降低肝脏和脾脏中沙门氏菌的载量[19]。Th17细胞能分泌抗菌肽，参与抗沙门氏菌感染[20]。T细胞作为获得性免疫的重要武器，它的成熟、激活、增殖、分化等受到诸多信号通路的严密调控[21]。研究表明，猪接种SCS活疫苗后，体内IFN-γ+CD8+T细胞介导的Th1类免疫应答在抗感染过程中发挥免疫保护作用[22]。

在抗感染过程中，γδT细胞可充当抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,APCs)，参与黏膜免疫，并可能与天然免疫和获得性免疫密切相关。目前在猪的研究中，γδT细胞的分布部位及其比例、亚群、受体表达和在抗感染方面的作用已有比较丰富的数据资料。与反刍动物和鸡等相似，猪具有丰富的在胸腺内发育成熟的γδT细胞，其在血液中分布较高(约18%～47%)，约占总淋巴细胞的85%[23]。根据其CD2和CD8表达的差异，猪γδT细胞可分为CD2-CD8-、CD2+CD8-和CD2+CD8+细胞3个亚群。不同亚群有不同的归巢特征和细胞毒活性。许多γδT细胞表达CD25和MHCⅡ类分子，并且抗原刺激后，CD25+、CD11b+、SWC1+、SWC7+γδT细胞的数量增加。此外，选择性抑制剂AR-A014418具有免疫调节功能，可以抑制γδT细胞的凋亡，并能增强其体外增殖和杀伤活性[24]。研究表明，在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染过程中，小肠上皮内CD8+γδT细胞参与细菌清除[25]。

3.2 B细胞的作用

根据表型和功能的差异，B细胞分为B1和B2细胞。B1细胞又分为B1a或B1b细胞，B2细胞进一步细分为边缘区B(MZ-B)和滤泡B(FOB)细胞[26]。与B1细胞在天然免疫中起作用不同，B2细胞执行获得性体液免疫功能。

成熟的初始B细胞能识别抗原、活化、增殖并分化成浆细胞，通过合成和分泌抗体而发挥清除病原体的作用[27]。关于猪B细胞的相关研究，主要包括B细胞发育途径、与小鼠B细胞的异同点、促进B细胞增殖分化的细胞因子以及在抗感染中的免疫功能等方面。在B细胞的发育途径中，IgH/IgLκ/IgL λ重排的各自顺序可能在不同物种中以不同且独立的方式进化。在小鼠和人，IgH和IgL重排顺序为IgH→IgLκ→IgLλ。而猪的模式为IgLκ→IgLλ→IgH→IgLκ→IgLλ[28]。研究表明，猪CD5+B细胞与小鼠B1细胞的组织分布相似，但功能不同[29]。细胞因子是对病原体和其他调节或介导免疫反应(如炎症等)的抗原产生反应的蛋白质。例如，IL-4、IL-5、IL-13和IL-21是B细胞生长因子，可刺激B细胞分化[30]。细胞因子可刺激B细胞中抗体亚型的转换，有利于辅助性T细胞的分化以及吞噬细胞杀伤作用的激活[31]。B细胞不仅可以产生特异性抗体来杀灭细菌，同时也可以作为APCs参与CD4+和CD8+T细胞应答。当同种抗原再一次刺激时，可迅速启动免疫记忆并激活效应B细胞快速分泌特异性抗体杀灭病原体，以维持机体健康。如果B细胞缺陷或者B细胞功能受损，会严重影响机体的抗感染免疫防御，包括抗原呈递作用、Th1记忆细胞的活化以及T细胞的功能。据报道，B细胞缺陷型小鼠(Igh-6-/-或Igμ-/-)的抗感染能力的缺失和免疫血清补充后小鼠免疫力的重建都证明B细胞在二次感染中的作用[32]。

综上所述，从猪源疫病的防控到人类疾病的研究，猪都是较好的动物模型。因此，了解猪的免疫系统及其对病原菌感染的免疫应答，将有助于对疾病的致病机理和免疫防控的研究。