兔斯氏艾美耳球虫病研究进展

白 鑫，孙安然，杨光友*

(1.四川农业大学动物医学院，四川成都 611130；2.四川省自贡市大安区农业农村局，四川自贡 643010)

兔球虫病是由艾美耳属(Eimeria)的多种球虫寄生于兔的肠道或胆管上皮细胞内引起的一种寄生虫病。随着规模化养兔的发展，兔球虫病的危害在近些年逐步显现，对我国养兔业的发展造成很大影响。在目前公认的感染兔的11种艾美耳球虫中，斯氏艾美耳球虫(E.stiedai)致病性较强、危害较大，且是唯一寄生在兔肝胆管上皮细胞内的兔球虫。

1 病原形态特征

斯氏艾美耳球虫卵囊一般为长卵圆形或近似椭圆形，卵囊大小为36.4 μm(31.3 μm～38.7 μm)×22.8 μm(19.1 μm～27.8 μm)，卵囊指数为1.59，不同地区分离株大小有一定差异[1]。卵囊一般呈淡黄或橘黄色，在较小一端往往呈削平状或凹陷，卵囊壁非常薄、整体上光滑均厚，成熟卵囊内没有外残体，有些卵囊存在散在颗粒状外残体，但因为孢子囊的遮挡而很难被看到。孢子囊为长卵圆形，一端有斯氏体，内残体明显。子孢子的宽端有一折光体位于核后，呈球形，约占子孢子纵长的1/3～2/5。

2 生活史

斯氏艾美耳球虫是少数几种寄生在肝脏胆管上皮细胞内的球虫之一，它的发育过程可分为裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖3个阶段。家兔食入孢子化卵囊后，经过肠道中胆汁和胰酶的作用，子孢子从卵囊中逸出，进入肠固有层淋巴管、肠系膜淋巴结，然后通过乳糜池进入血液循环，随着肝动脉流入胆管周围毛细血管丛并由此处侵入胆管上皮细胞。

子孢子钻入上皮细胞后，很快扩大变成裂殖体，经过多次分裂后形成许多裂殖子。这些裂殖子从死亡的上皮细胞中溢出，继续侵袭新的上皮细胞。在裂殖生殖阶段，Pellerdy L P等曾提出有5代或6代，裂殖体可分为A、B两型或三型。国内一般将裂殖生殖划分为4代，并首次提出肝球虫裂殖生殖具有多态现象，即裂殖体以多态方式产生下代裂殖子，包括子孢子型裂殖体、双核或多核的裂殖子型裂殖体、单核裂殖子型裂殖体和经典型裂殖体。经过多次无性繁殖，裂殖子会分裂发育成两性配子。两性的大小配子发育成熟后，小配子进入大配子结合为合子，合子外面迅速包上被膜后形成卵囊并随粪便排出体外。

刚从粪便中排出的卵囊还未孢子化，不能感染家兔。经过适宜的温度、湿度和氧气浓度的诱导，可发育成为具有感染力的孢子化卵囊。孢子化的完成意味着卵囊已具备感染力，过去曾经认为斯氏体的出现是孢子化完成的标志，但后来通过镜检观察发现，在子孢子发育早期即出现斯氏体，因此将子孢子的可分辨度及折光体的出现作为孢子化完成的标志比较合理。

3 流行病学

各种品种和不同年龄的兔都可感染斯氏艾美耳球虫，但以1月龄～3月龄的兔最易感而且病情严重，死亡率高。该病一年四季均可发生，阴雨季节多发，均呈地方性流行。斯氏艾美耳球虫病在我国分布范围很广，重庆、甘肃、海南、河北、河南、青海、江苏、山东、陕西、浙江、新疆等地均有报道。

4 致病性

患病的家兔通常表现出精神不振，食欲减退，动作迟缓，伏卧不动等症状。继续发展会出现鼻腔、眼部分泌物及唾液分泌增多，并出现贫血、黄疸及腹泻，虚弱消瘦，生长停滞。严重病例有时出现神经症状，站立不稳，四肢麻痹，病程较短，很快死亡[2]。剖检发现感染严重的家兔肝脏高度肿大，肝脏表面及实质内有黄豆大小的沿胆小管分布的白色或淡黄色结节。对结节病灶进行镜检，可以看到各个发育阶段的球虫，肝实质发生局部坏死。胆管增生变大，管壁明显增厚，胆管内充满暗绿色胆汁，镜检可见到大量卵囊及脱落的上皮细胞和炎性细胞浸润。有学者发现感染斯氏艾美耳球虫后丙氨酸转移酶、天冬氨酸转移酶、碱性磷酸酶和γ谷氨酰转肽酶活性升高，总蛋白、球蛋白、总胆红素含量升高[3]。也有学者检测了斯氏艾美耳球虫感染兔的血常规、肝功能和凝血4项等血液指标，肝功能指标与其他学者的结果基本一致，还发现乳酸脱氢酶显著增高，血清胆碱酯酶显著降低[4]。对人工感染斯氏艾美耳球虫后不同时间段血清中丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性进行检测，发现感染初期丙二醛含量明显升高，超氧化物歧化酶活性有明显下降，但后期可逐渐恢复至正常水平，表明感染所致的病理氧化应激可通过肝脏代偿维持[5]。

肝球虫的感染造成肝细胞的损伤和坏死，影响肝脏的分解、合成、生物转化及排泄功能，使得机体的代谢功能出现异常，最终导致家兔死亡。在一定的数量范围内，家兔吞食的卵囊数越多，表现出的病理变化越明显[6]。

5 诊断方法

5.1 卵囊漂浮检测

改进的饱和食盐水漂浮法，只取1粒粪便，加饱和食盐水搅拌后过滤进青霉素瓶中，用吸管从液面前后左右中5个方向吸取表面粪液滴加于带凹槽的载玻片上镜检。检测出了包含斯氏艾美耳球虫在内的7种球虫，可节省取样时间，操作简便[7]。

5.2 组织病理学检测

病理变化主要发生在肝脏，肝脏肿大并有结节病灶，镜检可观察到肝脏组织变性坏死，肝胆管上皮增生，可见大量不同发育阶段的虫体[8]。

5.3 血清学检测

Rose M E 采用补体结合试验检测感染斯氏艾美耳球虫病家兔血清中的抗体，最早可在感染后3 d～7 d检测到补体结合滴度的增加。Abu-El-Ezz N M T等[9]采用卵囊计数、组织病理学和ELISA进行诊断，发现使用卵囊抗原检测抗体的ELISA可在感染后1周检测到抗体，是早期诊断肝球虫病的最佳方法。

魏闻芮等[10]建立了一种以斯氏艾美耳球虫MIC-1和MIC-3重组蛋白为抗原诊断肝球虫病的间接ELISA方法，敏感性和特异性都非常高，感染后第6、8、10天均能检测到相应的抗体。

5.4 分子生物学检测

Oliveir U C等[11]建立了一种基于ITS1序列作为靶标分子进行PCR扩增来鉴别诊断11种兔球虫病的方法，种间无交叉反应，敏感性可达0.8个～1.7个孢子化卵囊。

闫文朝等[12-13]成功克隆了斯氏艾美耳球虫完整的 ITS1-5.8S rRNA-ITS2 序列，并以该序列为目的基因，建立了能有效检测出50个斯氏艾美耳球虫卵囊的灵敏性高、特异性强的PCR检测方法。还以此为基础建立了用于区分和鉴定斯氏艾美耳球虫病、肠艾美耳球虫病和黄艾美耳球虫病的多重PCR诊断方法。

汪运舟等[14]建立了基于全基因组扩增技术的兔球虫单卵囊PCR技术，能够在单个卵囊的水平上进行虫种鉴定，从而大大提高PCR反应的灵敏度。

Hassan K M等[15]提取了感染家兔粪便、全血样本、肝组织的DNA，基于ITS1序列设计引物进行PCR检测，发现最早可在感染后12 d从肝组织中检测到PCR阳性。

梁子平等[16]以球虫ITS1基因为种属特异性检测的PCR分子靶标，针对兔源11种艾美耳球虫病建立了多重PCR联检方法,对检测目标表现出了高敏感性和高特异性。该多重PCR联检方法平均最低可检测到大约0.8个～1.7个的孢子化卵囊。

温福利等[17-18]根据E.stiedaiITS1区域的基因保守序列设计引物，建立的实时荧光定量PCR方法特异性强，灵敏度高，可检出含1个卵囊DNA的样本，适用于感染初期的定量检测。还根据E.stiedai的ITS1-5.8sRNA-ITS2 基因序列设计特异引物，建立了环介导等温扩增(LAMP)检测方法，对待检样本进行10倍稀释后，仍能够检测到36 copies/mL的DNA样本，具有特异性和较高的敏感性。

6 免疫学

用免疫组化链霉亲和素-生物素复合物法对斯氏艾美耳球虫感染后家兔体内球虫抗原的分布进行观察，发现肝脏窦状隙、胆管上皮细胞、肝门淋巴结和脾脏内有明显的棕黄色阳性反应区，说明这些区域和部位有相应的E.stiedai抗原存在，且抗原数量最多的是肝脏，其次为脾脏，肝门淋巴结最少[19]。试验证明，斯氏艾美耳球虫感染家兔后可以激发体液免疫应答，产生的特异性抗体能够作用于卵囊抗原和粪便抗原，抗体水平高低能够说明保护性免疫应答水平的高低。

6.1 活疫苗

不同剂量的γ射线辐射可以不同程度地降低斯氏艾美耳球虫的致病性，45 krad的γ射线辐射剂量仍不能使孢子化卵囊致死。虽不能使接种动物发病，但能使动物感染，刺激机体产生相当程度的免疫保护力。

有学者用超声处理的卵囊免疫家兔，发现免疫组的卵囊产出要低于未免疫组，而血清抗体水平则高于未免疫组[20]。

6.2 亚单位疫苗

Hanada S等用从感染兔的胆汁中提取的裂殖体抗原免疫无球虫兔，发现免疫兔的胆管周围聚集较多的炎性细胞，而虫体较少，排卵量也少于未免疫的兔。Omata Y等用感染15 d后胆汁中的子孢子和裂殖体抗原免疫兔后再攻虫，免疫组卵囊排出数量比对照组少。Abdel K N等用粪抗原加弗氏佐剂免疫接种无球虫兔后，经口攻毒孢子化卵囊。结果显示，免疫组排出的卵囊数量减少，体液免疫应答水平也比对照组高，可以提供70%的免疫保护力。

6.3 疫苗候选基因与基因工程苗

有学者成功将微线蛋白和肌动蛋白解聚因子基因进行克隆并在真核细胞中进行了表达，也有学者原核克隆表达了菱形体蛋白、热休克蛋白、天冬氨酸蛋白酶基因并进行了Western blot分析[21-26]。

有研究者构建了微线蛋白与白介素IL-15共表达真核载体，并转入减毒鼠伤寒沙门菌，免疫试验结果表明，该重组菌能诱导机体产生较高水平的抗球虫细胞免疫应答和体液免疫应答，抗球虫指数达到160以上，具有中等抗球虫效力[27]。

7 药物治疗

由于还没有研究出商品化疫苗，目前斯氏艾美耳球虫病的防控主要依靠药物，妥曲珠利、地克珠利、α-二氟甲基鸟氨酸、莫能菌素、盐霉素、马杜拉霉素、拉沙洛菌素等都在临床中有应用。

赵爱云等[28]观察了3种抗球虫药对斯氏艾美耳球虫病的敏感性，结果表明，球虫血痢散(主要成分为磺胺喹噁啉)的增重效果较好,但是不能很好地抑制卵囊排出；球虫血痢清(主要成分为鹤虱、槟榔、雷丸等14种中药)在增重和抑制卵囊排出这两方面效果都比较好；试验虫株已经对兔血痢灵(主要成分为盐酸氯苯胍)产生了一定的耐药性。

Al-Mathal E M[29]观察了橄榄科植物没药(Commiphoramolmol)对兔肝球虫病的治疗效果，发现没药的商业化提取物Mirazid和天然产物都可以降低卵囊排出量，最终达到治愈的效果，但Mirazid更高效。

Baghdadi H B等[30]通过试验证实黑种草(NigellasativaL.)的种子混悬剂和油乳剂是一种安全有效的治疗斯氏艾美耳球虫病的药物。

王玺德等[31]通过试验证明灌服石榴皮水提物后，家兔排出的斯氏艾美耳球虫卵囊的比重显著减少；饲喂盐酸氯苯胍的家兔，排出卵囊的比重也减少。

宋宏晓等[32]对比了癸氧喹酯与妥曲珠利对斯氏艾美尔球虫病的治疗效果，发现在平均增重、卵囊排出量、病变记分方面，两组差异显著，妥曲珠利效果优于癸氧喹酯。

Indrasanti D等[33]发现大蒜提取物对斯氏艾美耳球虫的卵囊形成有一定抑制作用。

兰家花[34]在一份感染斯氏艾美耳球虫家兔的诊治报告中，采用氯苯胍按每千克精料加100 mg混合均匀；磺胺六甲氧嘧啶，按每千克精料加1 g混饲1周并配合饲养管理，用药3 d～5 d后患兔病情开始好转，用药2个疗程后，未见幼兔死亡，疫情得到有效控制。

Eladl A H等[35]使用商业化的植物提取物Herba Cox®治疗人工感染斯氏艾美耳球虫病的家兔，感染前7 d到感染后28 d连续使用，可以减轻临床症状，改善肝脏功能，减少卵囊排出，是一种新型安全高效的治疗方法。

从以上研究可以看出，对于抗斯氏艾美耳球虫病药物的研究，有从传统化学药物转向天然草本药物、从治疗为主转向预防为主的趋势。

8 展望

目前对斯氏艾美耳球虫病的防控仍是以药物防治为主，疫苗研究尚未取得实质性进展，还没有商业化疫苗问世。但是，随着基因组学的发展，更多的疫苗候选基因将被筛选评估，相信不久的将来就可以研制出安全高效的基因工程疫苗，给养兔业带来福音。