MFC监测MRD在AML形态学缓解患者中的应用价值

王 楠，冯砚平，陈 康，傅 强，王伟佳

广东省中山市人民医院检验医学中心，广东中山 528400

急性髓系白血病(AML)是一种恶性、异质性、克隆性疾病，具有高度基因复杂性。通过联合化疗诱导缓解后，80%的AML患者可以达到形态学完全缓解(mCR)，但是超过50%的成年患者会复发，这与化疗后微小残留病灶(MRD)的增殖有关。所以，寻找采用传统形态学方法无法观察到的MRD，对于指导临床治疗策略，改善疾病预后，延长患者生存期具有重要意义。多参数流式细胞术(MFC)通过使用荧光染料标记的单克隆抗体组来评估造血细胞的抗原表达，识别白血病相关免疫表型(LAIP)，可广泛应用于90%的AML患者，且检测速度快，灵敏度高[1]。本研究对138例经诱导化疗后达到mCR的AML患者进行了相关分析，应用MFC监测患者骨髓标本的MRD,分析其在AML复发与预后评估中的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年5月至2019年5月本院收治的经过1～2个疗程诱导化疗后达到mCR的AML患者(排除M3型)138例。所有患者均进行骨髓形态学、细胞遗传学、免疫表型、分子生物学检查，按照世界卫生组织(WHO)和FAB标准进行确诊和分型,参照2019年美国国立综合癌症网络(NCCN)AML相关标准进行危险分层[2]。

1.2方法

1.2.1治疗方案及疗效判断 白细胞水平过高的患者首先使用羟基脲或联合白细胞单采清除术降低白细胞水平。根据患者的年龄及各方面情况，采用IA、HAA、MA、TA、CAG及DCAG等方案进行诱导化疗。根据治疗效果及遗传学危险分层，预后良好的患者巩固化疗6～8个疗程，预后不良的患者在完全缓解后进行异基因造血干细胞移植，若无移植条件，则采用联合化疗。参照《血液病诊断及疗效标准》进行疗效判断，分为完全缓解、部分缓解、无效。

1.2.2MFC检测MRD 根据初诊时每个患者的免疫分型结果确定相应的LAIP，以此作为MRD检测的标志。于每次化疗后3周左右或下次化疗前抽取患者骨髓，采用MFC进行MRD检测(流式细胞仪由美国Becton-Dickinson公司生产)。以CD45/SCC设门，获取10 000～20 000个细胞，所使用的单克隆抗体包括cMPO、CD13、CD33、CD117、CD34、CD38、CD14、CD15、CD11b、HLA-DR、CD19、CD20、cCD22、cCD79a、CD2、CD3、CD4、CD8、CD7、CD10等，设定具有LAIP的细胞>0.1%为MRD阳性[3]。

1.3随访 采用查阅患者门诊、住院病历及电话联系等方式进行随访，随访日期截止2020年3月31日。总生存期定义为患者从确诊至死亡或随访截止的时间，无复发生存期定义为患者从mCR至复发或随访截止的时间。

2 结 果

2.1患者临床特征 138例患者中，MRD阳性31例，占22.5%。MRD阳性与MRD阴性患者性别、年龄、初诊时白细胞计数(WBC)、初诊时血红蛋白(HB)、初诊时血小板计数(PLT)、初诊时乳酸脱氢酶(LDH)水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。在化疗第1疗程达到mCR的患者中，MRD阴性有89例(83.2%)，MRD阳性有16例(51.6%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 MRD阳性与MRD阴性患者的临床特征比较

组别n初诊时PLT[M(P25,P75),×109/L]初诊时LDH[M(P25,P75),U/L]是否在化疗第1疗程达到mCR[n(%)]是否MRD阳性3135(10,62)444(275,589)16(51.6)15(48.4)MRD阴性10743(23,69)392(285,659)89(83.2)18(16.8)t/χ2/Z1.4220.60213.162P0.1550.547<0.001

2.2MRD阳性与阴性患者的疗效及生存分析 经过2～3个疗程化疗后，所有患者均达到mCR。中位随访时间为26个月，MRD阳性患者累计复发率为61.3% ，高于MRD阴性患者的48.6%(χ2=4.407，P=0.036)；MRD阳性患者总生存率为54.8%，低于MRD阴性患者的70.1%(χ2=4.332，P=0.037)；MRD阳性患者的无复发生存率为38.7%，低于MRD阴性患者的49.5%(χ2=4.408，P=0.035)。Kaplan-Meier生存曲线见图1。

注：A为累计复发率；B为总生存率；C为无复发生存率。

2.3MRD阳性患者接受不同治疗方案后的生存情况 31例MRD阳性患者在诱导缓解后有19例继续采用巩固化疗，12例接受异基因造血干细胞移植。巩固化疗患者总生存率为47.4%，低于异基因造血干细胞移植患者的66.7%(χ2=4.190，P=0.041)。Kaplan-Meier生存曲线见图2。

图2 巩固化疗患者与异基因造血干细胞移植患者的Kaplan-Meier生存曲线

3 讨 论

AML是一种具有高度异质性、进展快的血液系统恶性肿瘤。目前，随着医疗水平的快速提高及大量新药的研发应用，AML患者的完全缓解率明显提高，生存期延长。但仍有半数以上的患者会在缓解后一段时间内复发，导致生存期缩短，最终死亡，其主要原因是在达到mCR后骨髓中的MRD持续存在且出现增殖，导致AML复发。所以，MRD监测在指导个性化治疗、更早发现药物耐药性、预测复发，以及评价治疗效果等方面均具有重要意义[4]。目前，临床常用的定量检测MRD的方法包括MFC检测LAIP和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测特异性融合基因。RT-qPCR的优点是灵敏度和特异度高，但是通常用于检测特定遗传学及分子学异常的患者所存在的融合基因及基因突变[5]，如PML-RARA、RUNX1-RUNX1T1、CBFB-MYH1等融合基因及NPM1、FLT3等基因突变等，而存在这些遗传学及分子学异常的患者仅占所有AML患者的60%～70%[6]，因此该方法存在一定的局限性。MFC可以识别每个患者独特的LAIP，并将其作为该患者的MRD在后续样本检测中进行追踪，可广泛应用于90%的AML患者，且采用MFC检测MRD的灵敏度较高。

国内外多项研究肯定了MRD在AML mCR患者中的预后意义[7-10]。FREEMAN等[7]使用MFC评估2 450例成年AML患者MRD的研究指出，首次诱导化疗后MRD阳性患者与化疗后部分缓解患者的生存结局类似，特别是在中风险及高风险患者中；对于NPM1野生型中风险患者，两个疗程化疗诱导后，MRD阳性与不良预后显著相关。张莹等[8]对131例AML患者的研究显示，在获得mCR后接受巩固化疗的患者中，MRD阳性患者的5年总生存率和无复发生存率明显低于MRD阴性患者。本研究结果显示，MRD阳性患者累计复发率高于MRD阴性患者，总生存率和无复发生存率低于MRD阴性患者，与上述报道相似。

目前，对AML患者治疗前进行风险分层主要根据年龄、遗传学及分子学等，MRD对预后的重要意义提示可将其作为治疗后危险分层的参考依据，可根据AML治疗后MRD的状态来进行危险分层，并指导临床个性化治疗。以MRD为依据的危险分层相关研究大多数是针对急性淋巴细胞白血病(ALL)的，ZUGMAIER等[11]的研究发现，在3次强化治疗后完全缓解但MRD阳性的前体B-ALL患者中，经过靶向CD19+的博纳吐单抗治疗后，与MRD转阴的患者相比，MRD未转阴患者的总生存率、无复发生存率更低，缓解期更短。目前，在AML中以MRD为基础指导危险分层治疗的研究较少，1项国外的前瞻性临床试验将AML患者细胞遗传学和MFC联合用于评估巩固化疗后MRD的情况，用来指导患者的缓解后治疗，结果显示，在巩固化疗后MRD阳性的中风险患者中，异基因造血干细胞移植可以延长总生存期及无复发生存期，使其与MRD阴性患者的生存结局接近[12]。本研究也发现，MRD阳性患者中，巩固化疗患者总生存率低于异基因造血干细胞移植患者，说明异基因造血干细胞移植可以改善MRD阳性患者的预后，延长其生存时间。

综上所述，mCR后MRD阳性患者复发率高，采用MFC监测AML患者mCR后的MRD对患者预后具有重要意义，可以早期发现易复发患者，为个性化地制订缓解后治疗方案提供依据。但目前以MRD为依据指导临床干预措施这一观点仍需要大量的前瞻性研究来证明。