超分子溶剂萃取-气相色谱-串联质谱法检测尿液中苯二氮草卓类药物

刘金磊，顾捷，陈丽琴，阿民勿日他

1.内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古 呼和浩特010059；2.内蒙古医科大学法医教研室，内蒙古 呼和浩特010110

苯二氮䓬类药物具有抗癫痫、抗惊厥、镇静催眠等作用，但此类药物长期使用，会使用药者产生很强的依赖性，其用药风险远远超过获益[1]，此类药物滥用已经是一个全球性的问题[2]。苯二氮䓬类药物主要作用于γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能神经突触传导，表现为中枢神经系统抑制和肌肉松弛，过量使用可能产生短暂性失忆、认知能力降低，与乙醇或其他药物联合使用具有协同作用，并且较易获得，被认为是与各种犯罪有关最常见的药物[2-4]。苯二氮䓬类药物主要经过尿液排泄，因此尿液检测常作为摄入或者滥用该药物的依据。但该类药物代谢快、半衰期短，故快速检测方式及高效萃取方法的研究显得十分重要[4-6]。样品前处理方法主要有固相萃取法、液液萃取法、中空纤维液相微萃取法等[2，7-9]，前两者存在耗时长、成本较高及制备量较多等不足，后者萃取技术虽然试剂使用量较少，但操作步骤相对复杂。

超分子溶剂作为一种新型萃取技术，是指在水溶液环境下由两亲化合物胶体溶液自发组装和凝集形成的具有纳米结构的胶束聚集体[10]。两亲化合物胶体溶液多采用四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF）和烷基醇或者酸混合而成，形成的超分子溶剂可以从含水检材中有效萃取低分子量的化合物[11-14]。因此，本研究拟建立一种超分子溶剂萃取-气相色谱-串联质谱法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GCMS/MS）检测尿液中苯二氮䓬类药物。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

Agilent 7890B-7000D 气相色谱-串联质谱仪（美国Agilent 公司）；MDF-382 医用超低温冰箱（日本Panasonic 公司）；TW-NC12 金属浴氮吹仪（武汉泰特沃斯科技有限公司）等。

甲醇、四氢呋喃、1-己醇、丙酮（色谱纯，北京迈瑞达科技有限公司）。

对照品（劳拉西泮、地西泮、咪达唑仑、氟硝西泮、硝西泮、氯硝西泮、氯氮平、艾司唑仑、阿普唑仑）和内标（劳拉西泮-d4、地西泮-d5、氟硝西泮-d7、硝西泮-d5、氯硝西泮-d4、艾司唑仑-d5、阿普唑仑-d5）的纯度均≥98.0%，购自美国Sigma-Aldrich 公司。咪达唑仑和氯氮平的内标为地西泮-d5。

1.2 混合对照品储备液、工作液及混合内标工作液的配制

分别吸取各对照品溶液100 μL 于同一量瓶中，用甲醇配制质量浓度为50 000 ng/mL 的混合对照品储备液2 mL，再用甲醇逐级稀释为10 000、5 000、2 000、1 000、500、200、100、20 ng/mL 的系列混合对照品工作液。同法配制质量浓度为5 000 ng/mL 的混合内标工作液。储备液均置于-20 ℃冷冻保存备用。

1.3 尿液样品

8 名22～27 岁健康男性志愿者实验前均未服用过此类药物，实验前每名志愿者收集100 mL 空白尿液，混合后（共800 mL）于-80 ℃冷冻保存。志愿者单次服用阿普唑仑2 mg，分别在服药后8、24、48、72 和96 h留取尿液5 mL，将尿液冷冻保存于-80 ℃冰箱中。

所有志愿者签署知情同意书，本研究通过内蒙古医科大学医学伦理委员会审批（审批号YKD2019 0205）。

阿普唑仑（0.4 mg/片）片剂由内蒙古自治区精神卫生中心提供。

1.4 尿液处理方法

取10 mL 离心管，加入1 mL 尿液、10 μL 质量浓度为5 000 ng/mL 的混合内标工作液、1 mL THF 和200 μL 1-己醇，涡旋振荡1 min，以12 000×g离心5 min，将所形成的超分子溶剂层经孔径为0.22 μm 的有机过滤膜过滤后，转移到1.5 mL 离心管中，经TWNC12 金属浴氮吹仪吹干，用50 μL 甲醇复溶，振荡混匀后进行GC-MS/MS 分析。

1.5 分析条件

色谱条件：Agilent J&W HP-5ms 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm；美国Agilent 公司）；载气为高纯氦气，流速为2.25 mL/min；碰撞气为高纯氮气，流速为1.5 mL/min。升温程序：100 ℃1.5 min；以25 ℃/min 升温至280 ℃，1.5 min；运行23.7 min。前进样口温度为250 ℃；分流比为5∶1，进样量为1 μL。

质谱条件：离子源温度230 ℃，四极杆温度150℃，电子电离（electron ionization，EI）电压70eV，溶剂延迟时间9 min，数据采集采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，其余参数见表1。

1.6 超分子溶剂的选取

本研究的关键步骤在于超分子溶剂的选取及其最佳体积配比，根据谈义萌等[10]和ACCIONI 等[12-13]提出的研究方法，探索当1-己醇为200 μL，THF 分别为0.5、1、1.5、2 mL 时尿液中9 种药物的提取回收率，每个样品平行测定3 次。其次考察当THF 为1 mL，1-己醇分别为150、200、250、300、350 μL 时尿液中9 种药物的提取回收率，每个样品平行测定3 次。

表1 GC-MS/MS定性、定量监测离子对保留时间及质谱参数Tab. 1 Qualitative and quantitative monitoring of ion pair retention time and mass spectrum parameters by GC-MS/MS

1.7 方法学验证

1.7.1 添加尿液样品配制

取空白尿液样品，加入“1.2 节”配制的系列混合对照品工作液适量，配制成质量浓度分别为0.2、1、2、5、10、20、50、100 ng/mL 的一系列质量浓度添加尿液样品。

取空白尿液样品，分别配制质量浓度为0.2、5 和100 ng/mL 的艾司唑仑，1、10 和100 ng/mL 的地西泮、咪达唑仑、氟硝西泮和氯氮平，2、10 和100 ng/mL 的硝西泮和氯硝西泮，5、20、100 ng/mL 劳拉西泮和阿普唑仑的非混合添加尿液样品。

1.7.2 方法专属性

在实验前，将8 名志愿者的空白尿液混匀后取1 mL，按“1.4 节”和“1.5 节”进行操作和分析。

1.7.3 校正曲线与线性范围

取系列质量浓度添加尿液样品，按“1.4 节”和“1.5 节”步骤进行操作和分析，使用Microsoft office 2019 Excel 软件对药物质量浓度（x）和药物峰面积与内标峰面积比值（y）进行线性回归分析，计算线性范围[4]。

1.7.4 方法灵敏度

灵敏度常以检测限（limit of detection，LOD）和（或）定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）表示，在仪器分析中，常用信号值和噪声的比值，即信噪比（signal to noise ratio，S/N）来确定，一般以S/N 为10时的药物质量浓度作为LLOQ，以S/N 为3 时的药物质量浓度作为LOD[4，15]。

1.7.5 方法精密度和准确度

取不同质量浓度的非混合添加尿液样品各5 份，按“1.4 节”和“1.5 节”进行操作和分析，同一天内不同时间段分别测定5 次，连续测定5 d，采用随行校正曲线计算相应的药物浓度，从而计算得到日内和日间精密度及准确度，日内和日间精密度用相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）来表示，准确度用偏倚（%）来表示。

1.7.6 提取回收率

取不同质量浓度的非混合添加尿液样品各5 份，按“1.4 节”和“1.5 节”的操作和分析，记录相应的峰面积（SA）。取空白尿液样品同样按“1.4 节”的操作进行处理后，加入相应质量浓度的对照品溶液，每个质量浓度的尿液样品平行制备5 份，按“1.5 节”分析，记录相应的峰面积（SB），提取回收率为SA/SB×100%。

1.7.7 方法稳定性

取不同质量浓度的非混合添加尿液样品各3 份，分别置于室温（25 ℃）和冷冻（-20 ℃）2 种温度下放置15 d，按“1.4 节”和“1.5 节”进行操作和分析，考察尿液中9 种药物在上述条件下是否具有良好的稳定性。

1.8 统计学分析

使用SPSS 25.0 软件（美国IBM 公司）进行统计数据分析，计量资料的统计描述采用表示。满足正态性、方差齐性条件的计量资料涉及多个样本均数比较时采用最小显著性差异（least significant difference，LSD）和Student-Newman-Keuls（SNK）法进行单因素方差分析和两两比较。检验水准α=0.05。

2 结果与讨论

2.1 超分子溶剂的选取

表2 显示，选用1 mL THF，地西泮和咪达唑仑的提取回收率与0.5、1.5 mL THF 的提取回收率相比，差异有统计学意义（P＜0.05），而0.5、1.5 mL THF 下的提取回收率之间差异无统计学意义（P＞0.05）。0.5、1 mL THF 下，氯氮平的提取回收率之间差异无统计学意义（P＞0.05），但两者与1.5 mL THF 下的提取回收率比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。当THF≥2 mL时，加入混合对照品溶液后出现有机相与水相不分层现象，因此，1 mL THF 时提取回收率最高。

表3 显示，当1-己醇含量≥200 μL 时，各含量下劳拉西泮、氟硝西泮、硝西泮和氯氮平4 种药物的提取回收率两两之间差异无统计学意义（P＞0.05），但各自与含量为150 μL 时的提取回收率相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。当1-己醇含量≥200 μL 时，9 种药物的提取回收率已较高且较为稳定，为了节省有机溶剂，最终选取200 μL 1-己醇进行提取。

综合考虑，选取1 mL THF 和200 μL 1-己醇为最佳含量。

2.2 方法的专属性

图1 显示，内源性物质不会对检测结果造成干扰，该方法的专属性良好。

表2 不同含量THF的提取回收率Tab. 2 Extraction recovery rate of THF with different contents （n=3，，%）

表2 不同含量THF的提取回收率Tab. 2 Extraction recovery rate of THF with different contents （n=3，，%）

注：1）与1 mL THF提取回收率相比，P＜0.05；2）与1.5 mL THF提取回收率相比，P＜0.05。

药物劳拉西泮地西泮咪达唑仑氟硝西泮硝西泮氯硝西泮氯氮平艾司唑仑阿普唑仑THF含量1.5 mL 93.41±4.05 88.08±3.121）82.60±1.361）92.87±3.77 85.37±3.21 85.94±1.90 76.37±1.71 86.59±6.32 89.15±4.38 0.5 mL 98.66±4.97 88.57±1.791）83.87±0.561）92.17±7.21 80.67±5.93 87.63±5.31 91.84±4.362）86.43±2.95 88.53±2.68 1 mL 98.97±2.66 95.93±0.47 87.43±1.18 93.67±3.74 87.62±2.85 87.93±2.42 90.13±5.732）89.57±3.70 94.03±4.39

表3 不同含量1-己醇的提取回收率Tab. 3 Extraction recovery rate of 1-hexanol with different contents （n=3，，%）

表3 不同含量1-己醇的提取回收率Tab. 3 Extraction recovery rate of 1-hexanol with different contents （n=3，，%）

注：1）与150 μL 1-己醇提取回收率相比，P＜0.05。

图1 MRM总离子色谱图Fig. 1 MRM total ion chromatogram

2.3 校正曲线和LLOQ

表4 显示，尿液中9 种药物在相应质量浓度范围内具有良好的线性关系，LLOQ 为0.2～5.0 ng/mL。

2.4 精密度、准确度和提取回收率

表5 显示，9 种药物的日内精密度和准确度（绝对值）分别≤9.86%、9.51%；日间精密度和准确度（绝对值）分别≤8.74%、9.98%，提取回收率为81.12%～99.52%。

2.5 稳定性实验

表6 显示，不同保存温度下，尿液中9 种药物在15 d内具有良好的稳定性，相对误差为0.03%～10.75%。

表4 尿液中苯二氮䓬类药物的校正曲线和定量下限Tab. 4 Calibration curve and lower limit of quantification of benzodiazepines in urine

表5 苯二氮䓬类药物的精密度、准确度和提取回收率Tab. 5 Precision，accuracy and extraction recovery of benzodiazepines （n=5，%）

表6 苯二氮䓬类药物的稳定性Tab. 6 Stability of benzodiazepines （n=3）

2.6 志愿者尿液样品测定

根据已有标准[15]进行定性分析，8名志愿者尿液中均检出阿普唑仑，8～72 h 内尿液中阿普唑仑的质量浓度为6.54～88.28 ng/mL。在72 h 时，有2 人检出但低于定量限，3 人未检出，在96 h 时均未检出（表7），6 号志愿者服药后8h尿液中阿普唑仑的MRM色谱图见图2。

表7 志愿者尿液中阿普唑仑的质量浓度Tab. 7 Alprazolam concentration in the urine of volunteers（n=3，，ng·mL-1）

表7 志愿者尿液中阿普唑仑的质量浓度Tab. 7 Alprazolam concentration in the urine of volunteers（n=3，，ng·mL-1）

注：ND表示未检出；LLOQ表示定量下限。

志愿者1号2号3号4号5号6号7号8号留尿时间8 h 50.51±2.77 52.11±5.98 88.28±6.26 68.38±1.46 82.46±6.26 30.98±0.44 80.15±8.18 43.25±2.83 24 h 16.48±1.61 25.34±3.12 24.09±2.31 17.98±2.22 14.91±1.67 17.22±1.85 16.17±0.98 27.04±2.12 48 h 9.35±0.79 8.33±0.58 12.68±0.57 10.43±0.34 6.44±0.09 6.57±0.54 7.52±0.09 14.77±1.18 72 h ND 6.54±0.78 9.45±0.91＜LLOQ ND＜LLOQ ND 8.58±0.81

图2 志愿者尿液中阿普唑仑的MRM色谱图Fig. 2 MRM chromatogram of alprazolam in urine of volunteers

3 结 论

本研究基于四氢呋喃和1-己醇组成的超分子溶剂萃取，联合GC-MS/MS 进行测定的方法运用于尿液中苯二氮䓬类药物的分析，具有简便、快速、高回收率、高灵敏度、低成本等优点。应用本方法对阿普唑仑服药志愿者尿液进行分析，从志愿者8～72 h 尿液中检出阿普唑仑（6.54～88.28 ng/mL）。本方法可以满足实际尿液样品中苯二氮䓬类药物的定性定量检测要求，为临床治疗药物监测及司法鉴定中苯二氮䓬类药物中毒提供新的检测手段。