死后血浆和溶血样本中IgE的稳定性

王天琦，王天方，贾宇晴，曹志鹏，朱宝利

1.中国医科大学法医学院，辽宁 沈阳110122；2.天津市公安局河西分局物证鉴定所，天津300061

过敏性休克死亡是法医学鉴定的重要内容之一，由于缺乏特异性的病理形态学改变，导致此类案件的法医学鉴定具有一定难度[1]。过敏性休克主要由Ⅰ型超敏反应介导，免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）是介导Ⅰ型超敏反应的关键介质[2]。在既往研究报道[3]中已证实，死后血清IgE 的检测对过敏性休克的死因诊断具有辅助作用并已在实际工作中得到一定的应用。

在实际工作中，由于样本的送检、移交或检测不及时等因素造成样本需暂时保存，一般为冷冻保存，有时还需长期保存以备检。临床研究[4-5]结果表明，IgE 在正确采集下可以保存数周，在有抗凝剂的作用下可以室温保存11 周且维持其结构稳定不被降解，在-20 ℃条件下可稳定保存6 个月。动物实验[6]结果显示，大鼠死后血清IgE 在冷冻、室温及4 ℃条件下可稳定保存25 d。但在法医学实践中，尸体冷冻保存及死后变化常导致严重溶血，因此，探究IgE 在死后样本中的稳定性用于指导实际工作是很有必要的。

本研究拟收集死亡案例的血浆及溶血样本，对IgE 经-20 ℃、4 ℃、25 ℃3 种条件下保存、5 次反复冻融后及-80℃长期超低温冷冻保存后的稳定性进行初步探究。

1 材料与方法

1.1 样本来源及选取标准

本研究共选取39 例中国医科大学司法鉴定中心在2017—2018 年受理的非冷冻且死后48 h 内进行尸体解剖案例的心血样本，其中20 例在获取血液后立即以3 000×g离心20 min 获得血浆，血浆性状为无肉眼可见溶血，另外19 例血液在获取后用超声破碎法（500 W，20 kHz，5 min）致其溶血，制备成溶血样本。

由于大多数尸体在解剖前经过冷冻保存，较难收集到非冷冻且死后经过时间＜48 h 的过敏性休克死亡案例，故本研究收集的39 例为一般常见案例，死因为交通事故18 例、心脏性猝死17 例、缢死2 例、高坠2 例，其中男性28 例，女性11 例，年龄为21～67 岁。

本研究通过了中国医科大学伦理委员会的批准。

1.2 IgE在不同保存条件下的稳定性

取5 例血浆样本及5 例溶血样本，分为3 组，分别保存在-20 ℃、4 ℃、25 ℃，每组分装成6 份，每份200 μL，分别在第0、3、7、14、21、28 天检测样本IgE。

1.3 血浆和溶血样本长时间冷冻处理过程

取20 例血浆样本和19 例溶血样本，每例分为2份，每份200 μL。第1份于获取后立即检测，获得IgE初始浓度，第2 份经-80 ℃冷冻保存1 年（365 d）后检测IgE。

1.4 血浆和溶血样本反复冻融处理过程

取10 例血浆样本及10 例溶血样本，每例分为4 份，每份200 μL。第1 份于获取后立即检测，获得IgE 初始浓度；第2 份经-20 ℃冷冻40 min 后样本完全冻结，立即取出室温解冻，连续反复5 次后检测IgE；第3 份经-80 ℃冷冻30 min 后样本完全冻结，立即取出室温解冻，连续反复5 次后检测IgE；第4 份经-80 ℃冷冻再室温解冻，每次冷冻时间＞24 h，反复5 次后检测IgE。

1.5 IgE的检测方法

血浆和溶血样本的IgE 应用cobas e411 型电化学发光全自动免疫分析仪及配套人免疫球蛋白E 检测试剂盒（瑞士Roche 公司）进行检测。血浆样本使用仪器直接检测；溶血样本应用配套样本稀释液Diluent Universal（瑞士Roche公司），使用仪器自动稀释100倍后再进行检测IgE 浓度，以去除溶血对检测造成的干扰。

1.6 降解率的计算

在-20 ℃、4 ℃、25 ℃保存稳定性研究中，以初始浓度（0 d 时）为基础浓度，用经不同条件下保存处理后的浓度与之对比，计算降解率（degradation rate，DR），计算公式如下：

式中，C0为样本中IgE 的初始浓度（IU/mL）；Cx为保存3、7、14、21、28 d 后IgE 的浓度（IU/mL）。

1.7 统计分析

2 结 果

2.1 血浆及溶血样本中IgE在不同保存条件下的稳定性

血浆及溶血样本中IgE 随着保存时间的延长，浓度总体呈下降趋势，降解率呈升高趋势。3 种保存条件下28 d 后血浆中IgE 的降解情况大致相同，均值在15%左右。溶血样本保存28 d 后，相同条件下较血浆样本降解速度加快（P＜0.05），并且在25 ℃保存条件下降解速度快于-20 ℃和4 ℃保存条件（P＜0.05）。血浆及溶血样本中IgE 在不同保存条件下的稳定性检测结果见表1～2。

表1 血浆样本中IgE在不同保存条件下的稳定性Tab. 1 Stability of IgE in plasma samples under different storage conditions （n=5）

表2 溶血样本中IgE在不同保存条件下的稳定性Tab. 2 Stability of IgE in hemolyzed blood samples under different storage conditions （n=5）

2.2 血浆和溶血样本长时间冷冻后IgE浓度的比较

分别将血浆与溶血样本在-80 ℃冷冻保存1 年后的IgE 浓度与初始浓度进行比较，发现血浆样本在-80 ℃冷冻保存1 年后，其浓度与初始浓度相比差异无统计学意义（P＞0.05）。而溶血样本在-80 ℃冷冻保存1 年后，其浓度与初始浓度相比有所降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。血浆与溶血样本中IgE 浓度在-80 ℃冷冻保存1 年后的检测结果见表3。

2.3 血浆及溶血样本反复冻融后IgE浓度的比较

分别将血浆与溶血样本于-20 ℃保存40 min 冻融5 次、-80 ℃保 存30 min 冻 融5 次 及-80 ℃保 存24 h 以上冻融5 次后的检测结果与初始浓度进行比较，发现血浆和溶血样本经上述冷冻处理后，IgE 浓度与初始浓度相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。血浆及溶血样本中IgE 浓度在反复冻融后的检测结果见表4。

表3 血浆及溶血样本中IgE在-80 ℃冷冻保存1年后的检测结果Tab. 3 Detection result of IgE in plasma and hemolyzed blood samples frozen at -80 ℃for 1 year（IU/mL）

表4 血浆及溶血样本中IgE在反复5次冻融后的检测结果Tab. 4 Detection result of IgE in plasma and hemolyzed blood samples after repeated freezing-thawing 5 cycles（n=10，IU/mL）

3 讨 论

死后IgE 的检测对过敏性休克死亡案例的鉴定具有一定的辅助作用，但对不同保存条件下的样本稳定性研究也仅见于针对临床样本的相关研究[5]。在死后生物化学检测中，对于溶血样本的保存和检测也是重要的工作内容之一。因此，本研究参照文献[7]中针对死后样本氨基末端脑钠肽前体（N-terminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP）的稳定性研究，对死后血浆及溶血样本在不同保存条件下IgE 的稳定性进行了研究。由于样本量的限制，本研究仅纳入5 例血浆和5 例溶血样本，该样本量虽不足以精确反映各时间点的降解情况，但是可以反映常见3 种保存条件下降解的总体趋势，以期对实际工作的样本保存起到一定的指导作用。本研究结果表明，死后血浆样本中IgE 可保持相对稳定，在3 种保存条件下稳定性接近，28 d 时降解率均值在15%左右；而溶血样本中IgE 较血浆样本稳定性差，降解率高于血浆样本（P＜0.05），并且在25 ℃保存条件下最不稳定，降解率高于4 ℃及-20 ℃保存条件（P＜0.05）。因此，对于溶血样本，建议及时检测，若需保存应及时分离出血浆。

在实际工作中，当样本需要长期保存时，一般会首选冷冻保存以减少样本的降解，且一般认为温度越低降解越缓慢。本研究选择-80 ℃的保存条件进行长时间冷冻保存。结果表明：死后血浆样本在-80 ℃经过1 年冷冻保存后IgE 浓度保持稳定，差异无统计学意义（P＞0.05）；而溶血样本在-80 ℃经过1 年冷冻保存后则发生一定程度的降解，差异具有统计学意义（P＜0.05）。推测其原因，可能是在溶血后血细胞内大量蛋白酶释放[8]，虽然-80 ℃的低温可在很大程度上降低其活性，但长时间保存还是会造成IgE 的缓慢降解。

对IgE 的冻融稳定性研究中，有学者[9]将狗血清反复冻融25 次并进行检测，发现狗血清中IgE 浓度保持稳定；另有研究[10]将羊血清反复冻融15 次，也得到了相同的结论。上述研究初步证实了血清中IgE 的冻融稳定性，本研究参照动物实验文献及临床文献中NT-proBNP 冻融稳定性的处理方法[10-12]，对血浆和溶血样本进行3 种冻融处理以探究IgE 的冻融稳定性。结果表明，无论是血浆样本还是溶血样本，经-20 ℃保存40min冻融5次、-80℃保存30min冻融5次及-80℃保存24 h 以上冻融5 次这3 种冻融处理后，IgE 浓度保持稳定，差异无统计学意义（P＞0.05），证明在死后样本中，IgE 依旧具有良好的冻融稳定性。由于条件所限，本研究未收集到符合条件的过敏性休克死亡案例，仅能依据一般死亡案例探讨血液中IgE 的稳定性，有待在今后的研究中扩大样本量进一步验证。

综上，死后血液样本中IgE 具有良好的冻融稳定性，可耐受5 次冻融循环。IgE 在死后血浆中可保持相对稳定，并可在-80 ℃条件下长时间稳定保存，但溶血样本中IgE 稳定性较差，建议及时检测或分离血浆进行保存。