金黄色葡萄球菌的免疫逃逸策略①

杨思宇 范钊玮 李皖豫 崔玉东（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆163319）

金黄色葡萄球菌（S.aureus）是一种重要的条件性致病菌，定殖于约30%健康人群上呼吸道［1］。S.aureus可引发皮肤和软组织感染，包括毛囊炎、脓疱疮及烫伤皮肤综合征等，还可引发菌血症、心内膜炎（IE）、骨关节炎、中毒性休克综合征（TSS）等［2］。抗生素临床应用前，S.aureus引发的菌血症患者死亡率超过80%，青霉素的使用大大降低了感染死亡率，但耐药菌株也随之出现［3］。1959年首次采用改进的β-内酰胺类抗生素——甲氧西林进行治疗以来，关于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株的报道不断增多。医院相关MRSA（HA-MRSA）是目前各国医院感染的主要原因，过去几十年，社区相关MRSA（CA-MRSA）备受关注［4］。万古霉素是目前CA-MRSA和HA-MRSA严重感染的一线治疗药物，但其耐药菌株越来越多［5-6］。因此，预防和治疗S.aureus感染的疫苗研究成为热点。S.aureus毒力因子繁多，致病机理复杂，尚未获得有效的、可用于临床的S.aureus疫苗。因此，了解S.aureus免疫逃逸策略有助于开发基于免疫辅助疗法和安全有效的疫苗。

1 S.aureus可逃避抗菌肽

机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线是宿主屏障结构，如皮肤、呼吸道黏膜和肠道黏膜等。这些组织中含有高浓度抗菌肽（AMPs）和酶，可杀死或抑制入侵微生物。α-defensins是一种带有疏水区域的阳离子小分子肽，是针对S.aureus的主要抗菌肽，由中性粒细胞大量产生，占中性粒细胞颗粒蛋白的50%，可被分泌至周围环境或与成熟吞噬体融合杀灭细菌［7］。但S.aureus可利用毒力因子靶向作用于皮肤和黏膜屏障处的α-defensins，如葡激酶（staphylokinase，SAK）是S.aureus产生的一种胞外蛋白，可直接结合和杀灭α-defensins［8］。Cathelicidins是一种具有保守的N端cathelin域和可变的C端AMP域的抗菌肽，具有抗S.aureus活性，与α-defen‑sins共同存在于中性粒细胞颗粒蛋白［9］。但S.aureus溶血素和V8蛋白酶可靶向裂解Cathelicidins家族的LL-37使其失活［10］。破坏LL-37是S.aureus引发皮肤感染的重要环节，如过敏性皮肤炎患者LL-37水平下调，更容易感染S.aureus［11］。Lysozyme是一种在黏液分泌物中发现的溶菌酶，存在于眼泪、鼻涕、唾液、汗水和血清，通过攻击细胞壁肽聚糖杀灭细菌。S.aureus对抗溶菌酶的方式是利用O-乙酰基转移酶（OatA）将胞壁肽聚糖中的胞壁酸残基乙酰化，在细胞壁和酶活性位点间产生空间位阻进而抑制溶菌酶活性［12］。

2 S.aureus可逃避补体系统

逃避上皮屏障处抗菌肽杀伤后，S.aureus必须与补体系统抗衡［13］。补体系统是由30余种可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的多分子系统，“补充”机体免疫应答。病原感染期，补体具有3个主要功能：调节细菌表面以增强吞噬作用、产生炎症信号招募吞噬细胞、通过形成膜攻击复合物（MAC）破坏病原体。补体具有3种激活途径：经典激活途径、MBL激活途径和旁路激活途径，3种途径以不同方式激活，均通过C3转化酶裂解C3，形成C3a和C3b 2个片段，C3a是一种有效的趋化物，而C3b则通过与病原体表面共价结合并与其他补体成分形成蛋白水解复合物，通过裂解更多C3并在细胞表面沉积更多C3b放大级联反应。补体系统对正常免疫功能至关重要，因此，逃避补体是多种致病菌的优先策略［14］。

葡萄球菌蛋白A（SpA）是S.aureus最具特征性的毒力因子之一，除可被分泌至周围环境外，还可与细胞壁结合。SpA有5个免疫球蛋白结合结构域，可与免疫球蛋白Fc段高亲和力结合，通过干扰经典补体激活途径帮助S.aureus逃避宿主细胞吞噬作用，还可通过阻止C1q与细胞表面抗体-抗原复合物结合阻断经典补体途径激活［15］。免疫球蛋白第二结合蛋白（Sbi）是继SpA后发现的第二种具有较强抗调理特性的毒力因子，可与脂磷壁酸结合而锚定于细胞膜，并与Fcγ段和C3结合，为S.aureus逃避吞噬作用提供保障［16］。葡萄球菌超抗原样蛋白7（SSL7）也可靶向免疫球蛋白，与IgA1和IgA2结合，破坏IgA与细胞表面FcaRI相互作用，逃避FcaRI介导的吞噬作用。此外SSL7还可与C5结合阻止C5a产生和MAC形成［17］。葡激酶（SAK）除靶向抗菌肽外，还可裂解血液中的纤溶酶原为纤溶酶，降解IgG和C3b，有效破坏所有补体激活途径［18］。细胞外纤维蛋白原结合蛋白（Efb）可与C3d结合，通过阻止C3裂解、C3b沉积和C3转化酶形成阻断所有补体激活途径，Efb与C3d结合还可阻止B细胞识别C3d片段，从而破坏适应性免疫应答［19］。细胞外补体结合蛋白（Ecb）可与C3b结合，在细胞表面通过与补体因子H（FH）和C3b形成复合物，利用FH的调节活性导致C3b失活，干扰旁路激活途径［20］。Ecb也可干扰中性粒细胞通过补体受体1（CR1）识别C3b，破坏吞噬作用［21］。葡萄球菌趋化抑制蛋白（CHIPS）可有效干扰C5a和甲酰化肽，不仅可增强S.aureus的抗吞噬功能，还可干扰中性粒细胞迁移［22］。葡萄球菌补体抑制物（SCIN）是S.aureus靶向补体系统的最有效成分，可直接与C3转化酶结合抑制所有补体激活途径［23］。

3 S.aureus可逃避吞噬细胞

吞噬细胞吞噬入侵病原体后，通过次氯酸（HClO）和活性氧（ROS）等物质破坏被吞噬的病原体。模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）可识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），如酵母聚糖、脂多糖和肽聚糖等，触发一系列信号分子，使吞噬细胞吞噬病原体，产生杀菌物质，并激活炎症反应对抗入侵病原体［24］。巨噬细胞和中性粒细胞是先天免疫系统识别病原体后被募集至感染部位的主要吞噬细胞，是有效清除S.aureus所必需的细胞，但S.aureus通过直接攻击吞噬细胞、调节识别信号产生、阻止趋化信号抵抗其吞噬能力。

感染期间，先天性免疫产生多种趋化因子，如CXCL1、CXCL2、CXCL7和CXCL8［25］。CXCR2是表达于中性粒细胞表面的主要趋化受体，可识别上述4种趋化因子。但S.aureus分泌的半胱氨酸蛋白酶A（ScpA）可破坏CXCR2受体，通过裂解CXCR2 N末端导致其无法发挥功能［26］。吞噬细胞还表达其他趋化受体，如C5a受体（C5aR1和C5L2）和甲酰肽受体（FPR1、FPR2和FPR3）。甲 酰 肽 样 受 体-1（FPRL1）与FPR1密切相关，可与多种配体结合发挥作用，而FPRL1抑制蛋白（FLIPr）对FPRL1具有高亲和力抑制作用，对FPR1和FPR2也具有一定抑制作用，但程度较轻。S.aureus可产生与FLIPr具有73%同源性的FLIPr样（FLIPr-like）蛋白，也可抑制FPRL1、FPR1和FPR2，FLIPr和FLIPr-like蛋白孵育中性粒细胞导致FPR激动剂fMLF和MMK-1趋化活性完全丧失［27］。此外，FLIPr和FLIPr-like蛋白还可通过抑制Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类IgG受体（FcγR）破坏抗体介导的调理吞噬作用［28］。最近研究表明，葡萄球菌超抗原样13（SSL13）可以人类特有方式靶向FPR2受体，证明S.aureus在感染过程中对甲酰基肽受体的广泛靶向性［29］。TLR2可通过结合肽聚糖相关脂蛋白使吞噬细胞识别S.aureus，在抗S.aureus免疫中起关键作用；S.aureus通过葡萄球菌超抗原样3（SSL3）靶向结合TLR2，抑制由TLR2介导的中性粒细胞杀伤功能［30］。除SSL3外，S.aureus还通过由酚溶性调节蛋白（PSMs）介导的脱落细菌脂蛋白间接作用于TLR2影响其功能［31］。吞噬细胞在从血液迁移至组织过程中，表达P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1），进而与选择素结合并滚动黏附进入组织［25］。S.aureus通过分泌葡萄球菌肠毒素样毒素X（SELX）与糖基化PSGL-1结合破坏迁移，阻止选择识别和滚动黏附［32］。另一种毒力因子——葡萄球菌超抗原样5（SSL5）以相同方式靶向结合PSGL-1干扰吞噬细胞募集。此外，SSL5还可与几种重要的趋化受体N端结合，从而阻止C3a-、C5a-、CXCL1-和IL-8介导的吞噬细胞激活［33］。靶向AMPs和补体系统的几种毒力因子（如SAK、CHIPS和SCIN）可通过使C3转化酶失活而阻断免疫球蛋白结合，并抑制趋化性受体信号传导，从而干扰吞噬细胞募集和激活。吞噬细胞吞噬细菌后产生多种化合物破坏病原体，中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs），包括弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3，在清除感染和控制炎症中发挥重要作用。NSPs通过中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在细胞外杀死细菌，或被释放至细胞外环境直接杀死病原体、降解细菌毒力因子［34］。感染过程中，S.aureus通过产生3种细胞外黏附蛋白（Eap、EapH1和EapH2）非共价封闭催化裂隙并阻断酶活性，Eap在纳摩尔范围内即可表现出抑制活性，并在体内促进S.aureus感染［35］。此外，S.aureus还可产生多种具有裂解活性的双组分成孔毒素，这些毒素识别细胞表面趋化因子受体，一种成分与趋化因子受体结合，募集第二种成分，导致细胞膜形成孔道，致使细胞溶解损伤吞噬细胞功能［36］。如NK细胞作为固有免疫系统主要效应细胞之一，可快速识别并清除病原体，S.aureus可分泌LukED特异性识别CCR5以溶解NK细胞、树突状细胞（DC）等免疫细胞，破坏机体免疫应答［37］。

4 S.aureus可逃避适应性免疫应答

适应性免疫应答——体液免疫应答和细胞免疫应答是宿主抵御微生物入侵的重要武器。S.aureus逃避体液免疫应答的一个重要机制是通过SpA激活B细胞多克隆。SpA包含5个免疫球蛋白结合结构域，可结合IgG和IgM的Fcγ结构域及VH3家族的Fab部分，其中，SpA结合Fcγ主要阻止对S.aureus的调理吞噬作用，而结合Fab主要导致B细胞活化和克隆扩增。Fab结合可对B细胞产生超抗原作用，诱导人体内30%B细胞和小鼠体内约10%B细胞多克隆活化，从而限制宿主对其他S.aureus毒力因子的应答［38］。此外，研究表明，SpA与小鼠B细胞结合可导致B细胞受体及共受体CD19和CD21下调，抑制细胞增殖，导致细胞凋亡［39］。S.aureus还可作为兼性细胞内病原菌逃避体液免疫反应，如抵抗中性粒细胞的杀伤作用并在细胞内生长，或以小菌落变异体（SCVs）形式存在于上皮细胞，SCVs的持续存在使S.aureus引发促进疾病发生并反复感染宿主［40］。此外，对S.aureus产生的某些抗体反应可增强其毒性，如抗PVL抗体可增加小鼠皮肤脓肿及细菌负荷，抑制人中性粒细胞对S.aureus的杀伤作用［41］。

除干扰宿主抗体防御外，S.aureus还采用多种策略破坏T细胞防御。S.aureus可表达23种血清特异性超抗原（SAgs），如中毒性休克综合征毒素1（TSST-1）、葡萄球菌肠毒素B（SEB）和葡萄球菌肠毒素C（SEC）等［42］。SAgs可避开常规MHC分子限制的抗原提呈，通过结合T细胞受体的特定Vβ链激活T细胞，释放非特异性细胞因子，使免疫反应向Th1极化。SAgs刺激后，大量T细胞扩增导致IL-2局部消耗，从而抑制保护性T细胞应答［43］。此外，S.aureus肽聚糖（PGN）可下调SAgs诱导的趋化因子（如CX‑CL10）表达，防止T细胞募集。S.aureus还可分泌1种MHCⅡ类分子模拟蛋白（Map），是一种可驱动T细胞向Th2表型分化、诱使T细胞溶解或凋亡的毒素［44］。调节性T细胞（Treg）是免疫系统改善感染引发过度炎症相关损伤的重要机制，可预防自身免疫并对其他免疫细胞群体发挥有效抑制作用［45］。由于Treg的免疫抑制特性，多种病原体已进化出利用该细胞群体抑制保护性免疫应答的逃避策略［46］。如S.aureus的肠毒素A（SEA）可诱导FOXP3表达和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）表达，促使T细胞向Treg转化以抑制保护性免疫应答［47］。酚溶性调节蛋白（PSMs）可DC TLR2配体识别能力，降低DC活化T细胞的能力，抑制Th1分化并特异性诱导Treg产生［48］。S.aureus还可破坏Th17细胞发育，而Th17细胞对人类抵抗S.aureus感染至关重要［49］。S.aureus可通过其细胞壁肽聚糖乙酰化抑制抗原呈递细胞表达Th17-极化细胞因子，有效阻断溶菌酶介导的肽聚糖降解和模式识别分子模式释放，通过抑制Th17细胞记忆反应再次感染相同宿主［50-52］。

5 S.aureus毒素

S.aureus主要毒素可分为3类：成孔毒素（PFTs）、剥脱性毒素（ETs）和SAgs。成孔毒素可进一步分为4种类型：α-溶血素（Hla或α-毒素）、β-溶血素、白细胞毒素（leukotoxin）和酚溶性调节蛋白（PSMs）。Hla是一种对红细胞具有高度向性的成孔毒素，可破坏细胞膜完整性，并与LukE、D和HlgAB相互作用为S.aureus提供宿主的血红蛋白，促进其生长。Hla还可与金属蛋白酶10（ADAM10）结合，裂解宿主内皮细胞和白细胞［53］。小鼠模型中，Hla可加重血管通透性和脓毒症，这种通透性可能导致S.aureus从血液传播至宿主组织。研究证明，Hla-ADAM10相互作用可在小鼠肥大细胞存在的情况下维持S.aureus存活，并破坏血小板功能和中性粒细胞信号［54-55］。β-溶血素对人角质形成细胞、多形核白细胞、单核细胞和T淋巴细胞具有细胞毒性，并抑制内皮细胞IL-8表达，有助于S.aureus逃逸和诱导生物被膜形成［56］。Leukotoxin由2种不同的蛋白组成，组装形成β-桶孔。目前，已从与人类感染相关的S.aureus菌株中分离出4种双组分白细胞毒素：杀白细胞毒素（PVL）、γ-溶血素（HlgA，HlgC，HlgB）、白细胞毒素ED（LukE、LukD）和白细胞毒素AB/GH（LukAB/LukGH）［57］。这些成孔毒素由分类为“S”和“F”的2种不同蛋白组成，S-组分通过与细胞受体结合赋予细胞类型特异性，F-组分二聚化诱导构象改变，插入β桶跨膜通道之前发生低聚形成预孔。这4种白细胞毒素可溶解白细胞系细胞，杀灭中性粒细胞，促进S.aureus在宿主内存活［58］。PSMs是一种直接靶向宿主细胞的小分子肽，具有多种功能，包括促进宿主细胞活化和细胞裂解，在微摩尔范围内，PSMs具有明显杀伤中性粒细胞能力［59］。剥脱性毒素（ETs）也称表皮分解毒素，是S.aureus分泌的特异丝氨酸蛋白酶，通过识别并水解皮肤表层的细胞桥粒钙黏蛋白诱导皮肤剥落和水疱形成［36］。目前，已知的主要ETs为剥脱性毒素A、B、C、D（ETA、ETB、ETC、ETD），其中，ETA和ETB与人类皮肤损伤最为相关。SAgs可触发T细胞产生大量促炎细胞因子（IL-2、IFN-γ和TNF），从而引起高烧、皮疹、脱屑、呕吐、腹泻和低血压等症状，并可导致多器官衰竭［60］。

6 小结

S.aureus可产生大量免疫逃逸分子，通过破坏补体系统、阻止吞噬细胞发挥功能、逃避适应性免疫及分泌多种毒力因子入侵宿主并在宿主内生长存活，仅通过开发新的抗生素无法完全解决这一问题。既往S.aureus疫苗研制的常规方法遵循引发特定抗体原则，但成功率较低。随着研究发展，研究者越来越认识到细胞介导免疫对于改善疫苗免疫保护作用的重要性。但S.aureus已进化出复杂的策略逃避或抑制宿主免疫系统，其免疫逃避机制可能是免疫系统无法消除S.aureus的原因，对高效疫苗开发构成巨大障碍。S.aureus逃避机制的研究可增强研究者对S.aureus如何与宿主相互作用的基本理解，为S.aureus感染防治提供参考。