巨噬细胞起源、活化和功能异质性在放射性肺损伤中的作用研究进展①

张妮 杨揆 白健 秦鸿雁

（空军军医大学基础医学院医学遗传与发育生物学教研室，西安710032）

放疗是治疗肺癌、食管癌、乳腺癌等胸部肿瘤的有效手段之一。放射性肺损伤（radiation-induced lung injury，RILI）是胸部肿瘤放射治疗过程中最常见的并发症，包括早期的放射性肺炎（radiation pneumonitis，RP）和晚期的放射性肺纤维化（radia‑tion-induced lung fibrosis，RILF）两个阶段［1-2］。暴露于电离辐射下的肺组织不仅出现DNA损伤，且受损的肺泡上皮细胞可释放大量炎症因子导致肺脏组织微环境改变，进一步引发肺部炎症和肺纤维化。其中，炎症细胞，尤其是单核-巨噬细胞在肺组织炎症反应起始阶段到纤维化重塑阶段均发挥重要调控作用［3-5］。近期利用细胞命运示踪技术结合动物损伤模型研究发现，巨噬细胞是一群具有起源、活化和功能高度异质性的固有免疫细胞。在肺脏中存在几种不同的巨噬细胞亚群：有驻留在肺泡和间质的巨噬细胞，也有在损伤后由血液单核细胞迁移至肺脏分化而成的巨噬细胞［6］。此外，在不同的微环境因子刺激下，巨噬细胞表现出不同的活化模式，并呈现出不同的功能。如经典活化的M1型巨噬细胞发挥促炎和抗纤维化作用，而替代活化的M2型巨噬细胞则发挥抗炎和促纤维化作用［7］。

1 巨噬细胞起源异质性与RILI

长期以来人们认为组织定居巨噬细胞都是由骨髓来源的单核细胞分化而来。但近期利用细胞命运示踪小鼠的研究发现，巨噬细胞是一群具有起源异质性的固有免疫细胞。除小肠、皮肤巨噬细胞自成体后来源于骨髓造血单核细胞外，绝大多数的组织定居巨噬细胞并非来源于成体后骨髓单核细胞，而是来源于胚胎时期的卵黄囊和/或胎肝，并持续至个体发育成熟［8-9］。如脑的小胶质细胞起源于卵黄囊红系-巨噬前体细胞，皮肤朗格汉氏和肝脏库普弗细胞起源于卵黄囊和胎肝造血干细胞，肺泡巨噬细胞、腹腔巨噬细胞和脾脏红髓巨噬细胞起源于胚胎造血干细胞。这些组织定居巨噬细胞在静息或炎症状态下可进行原位增殖和自我更新，其不依赖或部分依赖于骨髓来源的巨噬细胞贡献［10-11］。

静息态下的肺脏巨噬细胞由分布于肺泡腔的肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AMs，siglecF+CD11b-F4/80+CD11c+）和分布于间质的肺间质巨噬细胞（interstitial macrophages，IMs，siglec-CD11b+F4/80+CD11c-）组成［12］。其中，组织定居的AMs起源于胚胎时期的卵黄囊阶段，具有自我更新能力，占肺脏巨噬细胞的75%，在维持免疫耐受中发挥重要作用［13-14］。而IMs既起源于卵黄囊期也起源于骨髓单核细胞，其更新依赖于骨髓单核细胞，构成近9%的脉管外髓系细胞，具有吞噬和清除进入肺间质异物的能力［15-17］。在炎症包括放射诱导的肺损伤情况下，肺脏巨噬细胞除了由AMs和IMs组成外，还包括在损伤后由血液单核细胞迁移至肺脏分化而成的巨噬细胞［6］。RILI后AMs和IMs处于动态变化中。在接受辐照15 d后，AMs的数目降到最低，直到16周，AMs细胞水平再次上升。而位于肺间质的IMs在辐照后第6天达到峰值，随后下降至稳定水平，直到辐照16周后，IMs细胞数目再次上升。在辐射15 d后，AMs大量死亡耗尽，而IMs不仅没有减少，其数量还有增加，表明IMs可能比AMs具有更强的抗辐射能力或者骨髓的单核细胞替代补充更加迅速［18-21］。而且大量研究表明这些炎性巨噬细胞可以转换成IMs和AMs进而发挥调控作用［4，22-23］。然而，这些不同起源的肺脏巨噬细胞是通过何种机制参与RILI与RILF的过程，尚有待进一步研究。

2 巨噬细胞活化模式与RILI

研究表明，巨噬细胞是一类可塑性强，免疫功能多样的细胞亚群。在不同的微环境、不同的刺激因子下表现为不同的活化状态［24-25］。即经典激活的M1型巨噬细胞和替代活化的M2型巨噬细胞。而M2型的巨噬细胞又依据其诱导分子和功能表型分为抗炎型M2a、免疫调节型M2b和创伤愈合型M2c。M1型巨噬细胞的激活依赖于细菌产物脂多糖（LPS）、IFN-γ或IL-12等刺激，具有清除细菌、释放促炎因子如IL-12、TNF-α、IL-1β和ROS以及降解细胞外基质等功能；M2型巨噬细胞的激活依赖于IL-4、IL-13和IL-10等刺激，具有抵御寄生虫感染、促进组织修复和释放免疫调节因子如IL-10、IL-4、IL-13和TGF-β以及分泌组织抑制因子（TIMP-1）拮抗金属基质蛋白等功能［26］。然而，来源于体外研究的M1/M2活化模式并不能真实地反映体内观察到的巨噬细胞表型。近期由于表观遗传学、基因表达和功能研究上的技术和分析方法进步，揭示了巨噬细胞的活化状态是一个超出M1/M2型巨噬细胞活化模式的谱系变化［27］。在不同微环境因子刺激下，巨噬细胞表现出不同的活化模式，并呈现出不同的功能。如经典活化的M1型巨噬细胞发挥促炎和抗纤维化作用，而替代活化的M2型巨噬细胞则发挥抗炎和促纤维化作用［28］。

多项研究结果表明，在RILI的早期RP阶段，巨噬细胞主要表现为M1型活化，释放细胞因子如IL-12，TNF-α、IL-1β和ROS等，以清除病原菌的作用。但在纤维化起始和进展期，巨噬细胞则表现为M2型活化。M2型肺巨噬细胞一方面在肺纤维化起始阶段释放ROS和分泌MMP-10、MMP-13、MMP-28，级联放大肺泡上皮细胞的损伤，促进Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡［29］；另一方面在肺纤维化进展期，M2型肺巨噬细胞通过释放促纤维化细胞因子TGF-β和Arg1，作用于肺内的成纤维细胞和周细胞，促进肌成纤维细胞的形成和细胞外基质的沉积，加重肺纤维化［30］。同样，在肺间质纤维化患者中，M2型巨噬细胞的表面标志物呈现高表达［30-31］。M1巨噬细胞的增多主要发生在放射诱导肺炎症阶段，在进展到肺纤维化阶段，巨噬细胞主要为M2型。因而LI等［32］将M2型巨噬细胞回输给巨噬细胞清除后的经辐照的肺脏组织，则肺纤维化再次重建。而回输M1型巨噬细胞对肺纤维化没有影响。提示M2型巨噬细胞在辐照诱导的肺损伤尤其是肺纤维化形成中发挥关键调控作用。目前大量临床肺纤维化患者研究支持了M2型肺泡巨噬细胞在纤维化中的作用［33］。因而，在RILI与RILF中巨噬细胞被分为促炎型和修复型两种类型，对肺脏的损伤和修复发挥“双刃剑”作用。然而，在RILI与RILF中调控巨噬细胞M1/M2活化的机制仍有待进一步研究。

3 巨噬细胞活化和功能调控与RILI

机体可以通过多种机制参与巨噬细胞活化和功能的调控，如以细胞因子介导的信号途径（IL-4、IL-13等）、胞内信号途径（JAK-STAT、NF-κB和Notch信号等）、转录因子（PPAR-γ、KLF4、IRF5和HIF-1α）介导以及一些表观遗传修饰等机制［33-34］。IL-13和IL-4分别与巨噬细胞膜表面的受体IL-13R和IL-4R结合，激活下游经典的JAK-STAT6信号通路，促进巨噬细胞向M2型活化，发挥抗炎和促修复作用［35］。HE等［36-37］利用Cu，Zn-SOD-/-小鼠研究肺纤维化时发现，在野生小鼠中线粒体Cu，Zn-SOD介导的H2O2大量产生诱发DNA受损，进而增强STAT6转录，促使巨噬细胞向M2型极化而导致肺纤维化。之后利用Cu，Zn-SOD转基因小鼠进一步证明了此现象。提示Cu，Zn-SOD通过STAT6调控巨噬细胞M2型极化而参与肺纤维的进展。近期，TAO等［38］利用博来霉素结合髓系Shp2条件性剔除小鼠建立肺纤维化模型发现，Shp2缺失导致IL-4介导的JAK1/STAT6信号活化进而诱导M2型巨噬细胞活化而加重肺纤维化。而ARRAS等［39］在二氧化硅颗粒诱导的小鼠肺纤维化模型中发现，IL-9通过抑制M2巨噬细胞极化而发挥抗纤维化作用。长期慢性过表达IL-10的小鼠同样通过促进M2型巨噬细胞极化和诱导CCR2-CCL2的表达而自发肺纤维化［40］。ZHAO等［41］研究同样表明在放疗诱导的肺纤维化中galec‑tin-3的高表达与M2型巨噬细胞呈正相关。敲低巨噬细胞系galectin-3可降低M2巨噬细胞标志物YM1的表达。这些数据均提示，细胞因子信号诱导的M2型巨噬细胞在不同因素诱导的肺纤维化进展中发挥重要的调控作用。

4 以巨噬细胞为靶点的抗纤维化治疗的前景

目前，激素和抗生素的常规治疗虽然能在一定程度上改善患者症状，但不良反应较多，且对已进展到肺纤维化的患者疗效甚微，因此，积极探寻新的治疗策略对RILI具有重要意义。巨噬细胞可产生大量抗氧化分子，如锰超氧化物歧化酶（Mn‑SOD），超氧离子（O2-）等，是人类细胞中抵御辐射能力较强的细胞之一［41］。因此，针对巨噬细胞进行预防或治疗RILI成为一种新的治疗策略。有研究者利用集落刺激因子1受体（colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R）的单克隆抗体特异性清除IM，可防治RILF［18，21］。抑制CCL2/CCR2信号轴，可阻止单核细胞迁移进入受辐照部位的肺组织，减轻肺纤维化［42］。因此，减少损伤肺组织中促进纤维化的M2型巨噬细胞可以作为预防和治疗RILI的潜在靶点。另一种治疗策略是将巨噬细胞重编程和免疫系统再教育，使巨噬细胞发挥抗纤维化的“好”的作用，从而减轻RILI。在肿瘤模型中，使用低剂量放射线可使巨噬细胞再教育为具有抗肿瘤作用的“好”的巨噬细胞［43］。在RILI中，也可通过将促纤维化的M2型巨噬细胞教育为“好”抗纤维化的M1巨噬细胞，从而防治放射性肺损伤［18］。因此，精准监测和调控放射诱导的肺脏巨噬细胞的活化表型可能是防治RILI与RILF的新策略。

近期，本课题组利用巨噬细胞特异剔除Notch信号途径关键转录因子RBP-J的小鼠建立博来霉素诱导的肺纤维化模型，进行组织Masson和天狼猩红染色发现：在肺纤维化模型中，敲除RBP-J的小鼠间质纤维化程度减轻。同时Notch信号减少了促纤维化的骨髓单核来源的肺泡巨噬细胞（MO-AMs）的募集和TGF-β的分泌，减轻小鼠肺纤维化。这些研究提示，靶向巨噬细胞的Notch信号可能是治疗肺纤维化的新靶点。骨髓来源的巨噬细胞募集到受损伤的组织主要依靠CCR2-CCL2分子信号轴，抑制CCR2-CCL2的信号轴可有效减轻小鼠博来霉素和RILI诱导的肺纤维化［42］。但抗CCL2的2期临床试验现已经提前终止，原因是患者预后没有明显改变，并出乎意料地导致其CCL2水平升高［44］。靶向受体CCR2减轻肺纤维化还未见相关报道。但有一个CCR2/CCR5双重拮抗剂目前正处于肝纤维化的临床试验阶段［45］。另外，IMs是辐射诱发的肺纤维化的主要驱动因素，IMs高表达CSF1R，因此CSF1R是治疗肺纤维化的潜在靶点。由于肿瘤相关巨噬细胞也高表达CSF1R，CSF1R的抑制剂正在进行肿瘤患者的临床试验［46］，从而预估其在肺纤维化中治疗中的作用。因此，尽管巨噬细胞在肺纤维化的发生发展中起重要作用，但由于其起源和功能的异质性，仍然需要更多、更深入的研究，这对于优化以巨噬细胞为靶点的抗纤维化干预措施具有重要意义。

放疗是治疗肿瘤的重要措施，通过联合其他治疗方法可提高肿瘤患者的生存期。RILI是其严重的并发症，更直接威胁肿瘤患者的生存质量，从而抵消放疗带来的益处，严重者甚至危及生命。揭示不同起源、活化模式和功能异质性的巨噬细胞在RILI与RILF中的作用及调控机制有望为肺纤维化的治疗提供新策略和新思路。