鼠进行性强直蛋白人类同源物与骨、关节疾病

于 鹏，翁习生

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1国际医疗部 2骨科，北京 100730

ANK即鼠进行性强直蛋白，又称无机焦磷酸盐转运调节蛋白，系位于小鼠细胞膜上的由492个氨基酸构成的多通道跨膜蛋白。该蛋白与其人类同源物(鼠进行性强直蛋白人类同源物ANKH)的主要功能类似，可以将细胞内的无机焦磷酸盐(inorganic pyrophosphate，PPi)转运至细胞外环境中，通过调节细胞内外PPi比例以及细胞外PPi和无机磷酸盐(inorganic phosphate，Pi)的比例进而调控组织钙化。PPi是矿化的抑制物，骨关节局部的高PPi浓度可以抑制羟基磷灰石的沉积，阻断关节软骨等组织不必要的矿化[1- 3]。ANK无意突变使细胞外PPi水平下降、细胞内PPi水平升高，进而导致骨关节中钙化调控异常，引发矿物质沉积，从而导致骨沉积异常、炎症和骨赘形成、异常钙化等[1]。有关ANKH的研究深化了人们对部分骨关节病的认识，并为骨关节病的诊断、防治提供了新的方法和方向。目前，ANKH被认为主要与强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)、颅骨干骺端发育不全(craniometaphyseal dysplasia，CMD)、软骨钙盐沉积等几种疾病相关。对该基因和上述骨关节疾病相关性的归纳总结，有利于提高研究人员对疾病的认知，推动相关疾病分子机制的研究。

ANKH与AS

AS是一种表现为背痛和进行性脊柱强直的中轴骨慢性炎症性疾病，也可同时累及髋关节、肩关节、肌肉起止点等。在疾病晚期由于软骨、软骨周围钙化以及纤维化导致脊柱不可逆的僵硬以及特征性的“竹节样”X线表现。ANK无意突变可以导致小鼠渐进性关节炎[4]。该疾病表现为渐进性的关节间隙变窄、椎间盘和脊柱韧带钙化、脊柱僵硬，和人类的AS极为类似，因此人们很自然地联想到ANKH可能与AS相关[4- 6]。关于AS和ANKH之间的相关性，目前研究主要集中在ANKH的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)和AS的易感性、严重性间是否存在联系。但各研究的结果间存在一定分歧。

一方面，有研究者以欧洲的高加索人种(葡萄牙人)为研究对象，分析了ANKH的4个SNP位点(rs27356、rs26307、rs25957、rs28006)，这些SNP与AS的易感性、症状严重性、起病年龄并无联系[7]。另一项基于英国人群(种族不详)的研究虽然发现了5个此前未发现的SNP，但最终结果表明这些SNP与AS同样没有关联[8]。

另一方面，研究者Tsui等[9]针对美国和加拿大的高加索人种的AS家系研究显示，AS的发病与ANKH的单倍型ANKH-OR等位基因1(即位于5’-UTR的 1～2个拷贝数的8 bp重复序列)和 ANKH-TR 等位基因7(即位于启动子区不同拷贝数的3倍重复序列)相关。该研究者在后续的同样针对美国和加拿大高加索人种AS家系的研究中，对AS家系进行了基因分型，结果显示位于ANKH碱基序列的两个不同区域与AS相关：rs26307/rs27356与男性罹患AS相关，而rs28006/rs25957则与女性罹患AS相关[10]。这项研究支持了ANKH与AS遗传易感性具有一定相关性，同时还揭示了这种相关性具有性别-基因特异性。针对我国北方汉族群体的研究显示，rs26307(T)/rs27356(C)单体型为AS的保护因素[11]。与Tsui等[9]研究结果不同，该研究中rs26307和rs27356位点基因型和单体型频率分布无性别差异；另外，该研究并未发现rs26307与男性患病相关。针对日本及中国台湾人群的研究显示，ANKH中的SNP c.963T>G(dbSNP ID：rs2288474)在日本人群中显示出较弱的相关性(P=0.045)，但在中国台湾人群中未显示出相关性[12]。

上述各项研究的异质性很高，所采用的统计量不同且无法互相转化，所以也无法对各研究的统计量进行统计学合并。各研究结果间的差异来源可能来自以下几个方面。首先，各研究所纳入的SNP间的重合度并不高，故而其结果间出现差异也并不出乎意料；其次，即使对于所纳入的SNP一致的几项研究，单就各研究的实验设计、研究类型、统计学方法等的异质性完全就可以解释其结果间的差异；另外，AS的易感性本身就与民族、种族有关，各研究的研究对象不一致很可能也会导致研究结果的不一致；最后，有研究者猜测ANKH仅是受到某些上游因素调控从而导致组织钙化的下游基因，因此，ANKH可能仅与局部钙化程度相关而与AS本身并不相关。

最后，随着近年微小RNA成为研究的热门，研究者们试图从这一表观遗传学层面研究ANKH和AS间的关系。一项新近的研究显示下调AS患者成纤维细胞中的miR- 17- 5p可以减少其成骨分化，这一调控作用是通过和ANKH的3’UTR结合、调节ANKH的表达水平实现的，该研究表明miR- 17- 5p的抑制物可以缓解AS模型大鼠的骶髂关节炎，抑制异位骨化[13]。该研究从一个侧面表明，即使ANKH和AS的起病、严重程度、易感性间并无相关性，ANKH仍具备成为AS治疗靶点的潜质。

ANKH与CMD

CMD是一种罕见的遗传性骨发育不良疾病。该病特征性的表现是肢体长骨的骨质减少以及颅、颌面部的骨质肥厚、硬化。部分严重病例也可由于骨异常增生压迫颅神经孔，导致面神经、前庭蜗神经、视神经的功能障碍。该病的遗传方式有两种：常染色体显性遗传(AD，MIM#123000，致病基因位于染色体 5p15.2-p14.1[14- 15])，以及常染色体隐性遗传(AR，MIM#218400，致病基因位于6q21- 22，较AD更为罕见[16- 19])。其中，遵循AD遗传模式的CMD即由ANKH的突变所致。有研究者通过对9个家系的突变进行研究显示6个导致该疾病的ANKH突变，这些基因突变包括单核苷酸替换、删失或者插入，这些突变均发生于高度保守的核苷酸残基，且均位于跨膜蛋白的细胞质侧，进而导致跨膜蛋白的构像变化[20]。除上述研究外，人们还发现其他位点的删失突变及插入突变[17]、单氨基酸突变[21]，外显子区的复杂杂合突变[22]、无意突变L244[23]、母源镶嵌性突变[24]等其他致病突变形式。上述这些突变所编码的氨基酸几乎均位于细胞内或者跨膜段，可以导致PPi转运功能异常，从而影响骨质钙化[25]。由于CMD较为罕见，因此研究者们尝试建立鼠CMD模型，在实验动物上进行有关CMD的细胞和分子水平研究。虽然ANK敲除小鼠(ANKnull/null)表型与CMD者类似，但是ANK敲除鼠只能复制出CMD的一部分表现，如颅骨厚度增加、中耳骨融合、枕骨大孔变窄以及股骨干骺端骨小梁减少[25]等。而鼻窦闭塞、下颌骨前突伴颌骨骨量增加、长骨肥大及干骺端肥大等特点则无法在ANK敲除鼠中获得。因此，人们尝试将表达ANK人类突变(Phe377缺失，TTC1130- 1132)的基因敲入鼠中，这种纯合子ANK敲入鼠(ANKKI/KI)成功地复制了几乎所有的人类CMD特征。在ANKKI/KI鼠的成骨细胞中PPi水平与正常对照组的PPi水平类似，均显著高于ANKnull/null组。事实上，在ANKKI/KI鼠成骨细胞中，另一PPi稳态的调节基因ENPP- 1的表达水平显著增加，这很可能弥补了ANK功能异常导致的PPi水平变化，这表明3组间的表型差异并不是单纯的源自成骨细胞PPi水平的差异。实验证明，ANKKI/KI鼠的破骨细胞生成减少。因此使得成骨/破骨间的平衡被打破，导致骨量异常增加，进而出现CMD相关的表型[26]。骨髓移植可以改善这种异常的骨量增加，很可能是因为移植的骨髓干细胞在体内发生分化，弥补了破骨细胞的缺乏[26]。由此可见，ANKH导致的破骨细胞生成减少是导致CMD表型的真正原因，同时也给CMD的治疗指出了方向。如果可将该方法[26]用于其他突变的研究，对于了解其他突变的致病机制将很有帮助。但目前仍然不知道突变的ANK是通过什么调控方式导致破骨细胞生成减少的。虽然ANK的蛋白构象研究目前仍停留在软件预测的程度上，但仍旧可以推断，ANKH的致病突变很可能是由于碱基突变导致跨膜蛋白构像发生变化，从而造成某些通路的异常活化或失活，最终导致破骨细胞产生减少的后果。

和其他大多数罕见基因病一样，虽然研究者们了解了CMD发病的分子学机制，但是目前并无针对CMD的有效治疗。动物实验表明，补充磷酸盐并不能改善本病的骨骼异常[27]。而存在低血钙的CMD患者究竟应该补钙治疗还是应该低钙饮食尚存在争议[28]。补钙可以改善CMD患者的甲状旁腺素升高和低血钙，但这样是否真的可以改善预后目前尚无有力证据[29]。手术解除神经压迫、纠正关节僵硬、调整面部外观可以用来改善神经压迫症状、提高生活治疗、改善社交[30- 31]。虽然在动物实验中发现骨髓移植可以改善异常增加的骨量，但距离应用于临床尚有十分遥远的距离。ANKH敲入鼠除了出现CMD相关表型之外还存在破骨细胞功能异常；而存在Phe377缺失或Ser375缺失的CMD患者的人源多能干细胞可以稳定地分化为破骨细胞，因而这两者具备成为工具动物、工具细胞以研究CMD等其他破骨细胞相关疾病的潜质[32]。

ANKH与焦磷酸钙沉积

焦磷酸钙(calcium pyrophosphate，CPP)晶体沉积(calcium pyrophosphate deposition，CPPD)在关节软骨钙化(chondrocalcinosis，CC)时十分常见[33]。CPP沉积可能表现为急性焦磷酸盐晶体性关节炎，CPPD并发骨关节炎(osteoarthritis，OA)，慢性CPP晶体炎症性关节炎或无症状关节钙化[34]。历史上，由于这些CPPD疾病的临床症状和痛风、类风湿关节炎等很类似，故而被称之为 “假性综合征”，即假性痛风和假性类风湿关节炎[35]等。后来，这些名称被欧洲风湿病联盟公布的新名词取代。CC可以散发于关节病变的患者中，也可呈家族性分布。

散发性CC在人群中十分常见。导致CC的高危因素众多，高龄、骨关节炎是十分重要的危险因素[34]。实际上，CPPD并发OA在临床上十分常见，OA患者也在散发性CC患者中占据相当大的比重。因此，有关散发性CC的研究很多都以OA患者或OA动物模型作为研究对象和实验材料的来源，因而有关CC的很多研究结果也可以推广至OA。CC在OA发生发展中的角色并不完全清楚，但可以确定的是，CPPD和OA存在密切联系。一方面，CPPD普遍存在于OA患者的关节软骨中，可以涉及整个膝关节软骨，甚至包含肉眼观测正常的负重区；同时有充足证据证明这些晶体可以启动、放大骨破坏，参与关节损伤[34]。另外，关节液中CPPD的存在可以用来预测OA患者关节损伤的严重程度和关节破坏速度[36]。PPi作为CPPD的阴离子组分，其调控基因ANKH也受到研究者的重视。概括地说，ANKH可以调控CPPD在关节组分中的沉积，参与OA的形成和进展。有研究者发现体外培养的合并CPPD的软骨细胞和合并CPPD的软骨提取物中ANK mRNA的基础表达高于普通OA患者的软骨或正常软骨，而且与没有CPPD沉积的对照组OA患者相比，CPPD沉积患者的关节组织中ANK蛋白和mRNA的水平增加，表明ANK在CPPD晶体形成中起到了直接作用[37]。在晶体沉积物附近的软骨细胞中，ANKH的免疫荧光强度也明显增强。另外，OA患者的受累关节软骨细胞易于在体外被诱导钙化。在这些细胞中，与矿化过程有关的几个基因，包括ENPP- 1和ANKH的表达可见上调[38]。上述研究表明，ANKH参与了关节软骨的晶体沉积。另有研究显示OA患者的半月板细胞也存在CPPD晶体，并在OA患者半月板中发现了ANKH的表达异常，并且表达水平的异常程度随着OA严重程度的增加而增加[39- 41]。除了关节软骨和半月板细胞外，还有研究显示OA患者的成骨细胞中的ANKH表达增加，在硬化的成骨细胞中观察到的ANKH高表达可能是局部PPi积累的原因[42]。

除了ANKH对CPPD的调控研究外，尚有研究显示软骨钙化与ANKH的5’UTR中的SNP- 4bpG>A存在关联[43]。虽然在欧洲人中上述SNP与散发型CC有关[44]，但是，在同为雅利安人种的以Khatris为种姓的印度OA人群中却并未发现这项突变[45]。这一研究结果间的差别是因为病例数不够大还是由于种族间的差异，抑或其他原因目前尚不清楚，ANKH的其他SNP是否与OA存在关联也不得而知。

有研究者发现，将大鼠关节软骨细胞暴露于白介素- 1β、肿瘤坏死因子α可以使细胞外无机磷酸盐含量下降，暴露于生长因子可以使胞外无机磷酸盐含量上升[46- 47]。转化生长因子-β对于诱导ANKH表达尤为有效，具有增加软骨细胞释放PPi的能力[48]。上述因子都是OA形成的重要分子机制，再加上ANKH在软骨细胞、半月板细胞、软骨下骨中均有表达并与钙化、晶体形成等过程相关，所以该基因对于防止和逆转晶体沉积，阻止退变性关节炎的进展存在理论上的可能性[36]，具备成为预防、治疗靶点的潜质。

CPPD还可以作为家族性遗传病而存在。目前已有多个国家和不同种族的家系报道，遗传模式通常是常染色体显性[49- 54]。与CMD患者的负性功能突变不同，家族性CPPD患者的突变通常为功能获得性突变[25]。该病主要临床表现为家族性早发性(通常在20～40岁)CPP晶体性关节炎，伴有多关节钙盐沉积，轻重不一的结构性关节炎/骨关节炎。该病还有第2种表型，发作于60～70岁，表现为少关节的钙盐沉积，更类似于散发的CPPD[55]。在儿童期良性发病似乎是一个早期多关节发病的英国家系所独有的。导致该病的染色体5p15上的致病基因CCAL2(MIM 118600，即ANKH)即首次在这个家族中被鉴定出来[56]。在美国的另一个合并早发OA和相关CPPD的家庭中，则发现了该病的另一个致病基因，位于染色体8q(CCAL1，MIM 600668)[57]。有研究将导致CPPD的ANKH突变(ΔE490)转染入成软骨细胞ATDC5中，实验证明ANKH和组织非特异性碱性磷酸酶的相互作用有利于正常组织矿化，而ANKH的功能异常即可导致组织非特异性碱性磷酸酶的调控异常。加上其他尚不明确的调控因素，导致病理性矿化发生，出现CPPD[58]。该研究者的另一项研究还将同样可以导致CPPD的ANKH的突变M48T转染入ATDC5细胞中，实验发现ANKH M48T突变蛋白丧失了与钠/磷酸盐共转运蛋白PiT- 1相互作用的能力。而PiT- 1则可以调节Pi和PPi的稳态[59]。这些研究初步说明ANKH突变所导致CPPD的分子机制，即突变导致结构异常，进而导致蛋白质互相作用异常。由于上述突变所造成的功能异常稳定且可在细胞水平进行验证，故而这些携带ANKH突变的细胞同样具备成为工具细胞的潜质。

无论是家族性的焦磷酸钙蛋白沉积病还是散发型的焦磷酸钙蛋白沉积病，目前的治疗方法都和骨关节炎、类风湿性关节炎乃至痛风类似，主要是对症及抗炎治疗。在疾病的急性发作期早期或慢性CPP关节炎的早、中期，均以非甾体类抗炎药、糖皮质激素治疗，羟氯喹、甲氨蝶呤等免疫抑制治疗为主。可用于治疗痛风的秋水仙碱、白介素- 1抑制剂可能对该病也有效。和OA一样，在CPPD疾病的终末期关节置换术仍然是改善症状及关节功能的优选治疗方案。目前尚无作用于ANKH的减少晶体形成的治疗方法。究其缘由，首先，目前尚缺乏高选择性调节ANKH表达水平的治疗手段，关节局部的RNA干扰虽不失为一项有前景的治疗方法，但目前尚无此类研究出现。其次，在控制异常钙盐沉积的同时如何还能够不影响正常骨质钙沉积也是有待解决的难题。最后，PPi平衡的稳态同时还受其他基因调控，单一改变AKNH的表达能否起到预期的结果也不得而知。

综上，ANKH是骨关节组织钙化的重要调节物，在AS、CMD、CC等骨关节病的分子机制中扮演了重要角色。对于AS，虽然ANK无意突变可以导致小鼠与AS类似的表现，但ANKH的SNP与AS的相关性间目前尚有争议。尽管如此，通过微小RNA对ANKH表达进行转录后调节依然可能改善AS的严重程度。对于CMD来说，目前人们已经发现了多种ANKH的致病突变形式。破骨细胞生成减少(可能系因ANKH突变导致蛋白构象改变)是导致CMD表型的重要原因。骨髓移植可能成为CMD的治疗方法。对于散发性CPP沉积病，ANKH通过调节CPP沉积参与CC、OA等CPPD沉积相关疾病的发生发展；对于家族性CPPD，ANKH突变则是主要病因之一。目前研究主要集中于ANKH与上述疾病的易感性、起病及发展的分子机制，以及使用携带该基因突变型的细胞、动物作为疾病和细胞分化异常研究工具。目前尚缺乏的研究方向有：ANKH突变与蛋白构象改变、调控异常相关性的研究，如何精确地、局部地改变ANKH表达的研究，以及将ANKH作为治疗靶点的疾病治疗研究。近年，有关该基因的研究和尤其是骨关节病的研究不多，近年所检索到的有关ANKH的研究很多是将其作为组织钙化的标记物。此外，由于ANKH的表达受微小RNA的影响[13，60]，微小RNA及RNA干扰技术可能使ANKH成为治疗靶点，具备应用潜质，但目前该方向的研究仍极度缺乏，有待研究者们进一步探索。