超基因：基因表达的“多面手”

刘 涛，王树森，3，4，杨 磊，时 乔，沈中阳，3，4

天津市第一中心医院 1中国医学科学院移植医学重点实验室 2国家卫生健康委员会危重病急救医学重点实验室3天津市器官移植临床医学研究中心 4器官移植中心 5检验科，天津 300192 6天津中医药大学研究生院，天津 301617

在生物体中，将遗传密码体现为生物的性状及各种生理活动过程，都离不开基因的表达，即基因组DNA转录生成信使RNA(messenger RNA，mRNA)等，并参与翻译生成蛋白质。在基因表达过程中，早期的观点主要集中在“中心法则”，即遗传信息按照“DNA-RNA-蛋白”的方向进行表达。然而，在庞大的基因组中，编码蛋白的序列所占的比例不足全部序列的2%[1]，这一现象曾令科学家感到困惑。近年来，发现基因组的转录产物中不仅有可编码蛋白的RNA，还有很多非编码RNA，主要包括微RNA(microRNA，miRNA)、环状RNA(circular RNA，circRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等。据估计，人类细胞中约有60%的序列能够被转录[2]。这些非编码RNA的功能虽已有一定的研究，但相对于编码RNA来说，非编码RNA的转录模式和功能还远未完全阐明。

非编码RNA的转录模式较为复杂。有些非编码RNA可能依靠其独立的启动子起始转录，但更多的非编码RNA转录元件与编码RNA具有一定的联系。一些非编码RNA可与邻近的编码RNA共同转录[3- 4]，或转录自蛋白编码基因的启动子区域[5- 6]或增强子区域[7- 8]。另一些非编码RNA可能由编码RNA前体的可变剪接生成[9]。此外，非编码RNA的转录还存在细胞和组织特异性[10]。如果一个转录位点在特定的条件下，可转录生成一个以上的RNA产物(包括编码RNA和非编码RNA)，则该基因位点被称为“超基因”。超基因共分为3种类型，分别为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，本文分别介绍各型超基因的转录特征，并以实例的方式阐述其在细胞中的调控作用，特别是在肿瘤细胞中的生物学活性。

Ⅰ型超基因

Ⅰ型超基因是指同一个基因位点在不同的条件下，能够生成不同起止位点的RNA转录本，且这些不同的RNA可能分别作为编码RNA或非编码RNA。这类超基因的数量较少，常见的发生条件是细胞遭受紫外线照射等应激过程。例如，活化信号合成物复合体亚单位3(activating signal cointegrator 1 complex subunit 3，ASCC3)是一个较为典型的Ⅰ型超基因，该基因在细胞遭受紫外线照射损伤后的不同阶段，能够生成不同的转录产物。具体来说，当细胞被紫外线照射后，细胞将启动损伤修复过程，同时细胞中大多数基因的转录过程被抑制，避免生成错误的转录产物。在这一过程中，ASCC3主要生成编码mRNA，其蛋白产物是维持细胞转录抑制状态的关键因子。而在DNA损伤修复的后期，ASCC3改为转录生成一段较短的非编码RNA，该RNA能够对抗ASCC3蛋白的转录抑制作用，从而使细胞内的RNA转录过程逐渐恢复正常[11]。类似地，整合因子复合体亚单位(identified integrator complex subunit，INTS)6也具有Ⅰ型超基因的调控特点。在正常情况下，INTS6转录并编码生成由887个氨基酸构成的蛋白产物。而在细胞遭受紫外线照射后，INTS6转录生成一段较短的RNA，编码仅115个氨基酸的蛋白片段。INTS6与INTS3等因子相互作用，构成单链DNA结合蛋白1复合物，参与DNA同源重组形式的损伤修复过程[12]。通过 Ⅰ 型超基因这种精巧的调节机制，ASCC3、INTS6等基因位点在DNA受到紫外线损伤的不同阶段生成具有不同长度和功能的转录产物，在DNA损伤修复过程中发挥重要的调节作用。

Ⅱ型超基因

与Ⅰ型超基因不同，Ⅱ型超基因转录生成单一的RNA产物，但通过转录后剪接和加工等过程，可生成不同序列和不同功能的两种或多种RNA。可变剪接在真核细胞的转录后加工过程中较为普遍，因此这类超基因的种类较多。根据生成RNA的种类不同，Ⅱ型超基因可分为以下几种类型。

源于编码基因内含子的小片段非编码RNA一些miRNA的转录生成过程，是随其“宿主”基因一同转录后，通过转录后的剪接过程，产生miRNA的前体，进而生成成熟的miRNA。那些随着真核细胞mRNA的加工成熟过程，由内含子生成的miRNA前体，被称为“mitron”[13]。例如，心脏特异性的miR- 208源于编码α肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain，αMHC)基因的内含子，该基因除了编码αMHC蛋白，参与心肌收缩功能之外，还由其内含子生成miR- 208，该miRNA能够调控应激和激素反应时的心肌收缩性[14]，从而使这两种转录产物实现协同作用。类似地，miR- 483- 3p源于胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)的内含子，其在多种肿瘤中发挥抗凋亡的活性。然而，miR- 483- 3p和其宿主基因IGF2的表达水平并无明显的一致性，该miRNA与IGF2编码产物是否存在协同作用有待进一步研究[15]。此外，一些环状RNA也来源于编码基因的内含子，这类环状RNA伴随内含子的剪接过程而生成，并能够促进相应宿主基因的表达[16]。

由编码基因位点生成的内源性小干扰RNA小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)是一种外源合成后导入细胞，对目的基因的表达进行抑制的短片段双链RNA，常作为基因功能研究的工具。然而，细胞也会产生内源性的siRNA(endo-siRNA，esiRNA)。Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1K(protein phosphatase，Mg2+/Mn2+dependent 1K，PPM1K)基因的逆向转录产物，即假基因ψPPM1K中包含反向重复序列，能够产生发夹结构，并加工生成esiRNA，该esiRNA可靶定并抑制非有丝分裂基因A相关激酶8(never in mitosis gene A related expressed kinase 8，NEK8)的表达。在人肝癌细胞中，PPM1K蛋白及ψPPM1K生成的esiRNA表达减低，导致esiRNA对NEK8的抑制作用减弱，引起NEK8的表达升高。NEK8能够对抗ψPPM1K对细胞生长的抑制作用，这一过程是肝癌细胞增殖加速的机制之一[17]。

由长链非编码RNA加工生成的小片段非编码RNA短片段的非编码RNA除了可以在编码基因的mRNA加工成熟过程中产生，有时也能由lncRNA的转录后加工过程产生。例如，lncRNA转移相关肺腺癌转录本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)在转录后，即被RNA酶P切割成两条非编码RNA，其中位于5’端较长的RNA链为MALAT1的成熟序列，位于3’端较短的RNA链具有和转运RNA(transfer RNA，tRNA)相似的“三叶草”样二级结构，最终生成一段61 nt的非编码RNA。和MALAT1主要定位于细胞核不同，这段短链的RNA主要定位于细胞浆，因此被命名为MALAT1相关小胞浆RNA(MALAT1-associated small cytoplasmic RNA，mascRNA)。mascRNA作为tRNA的类似物，可能参与翻译过程[18]，并影响单核-巨噬细胞系统，参与心血管系统的免疫调节过程[19]。

源于tRNA的小片段非编码RNAtRNA的前体或成熟体也能够在5’端或3’端进行剪切，生成与miRNA长度类似的小片段非编码RNA，这类RNA被称为tRNA来源的RNA片段(tRNA-derived RNA fragments，tRF)[20]。这些小片段RNA并非tRNA加工过程产生的“废物”，而是在细胞功能调控中发挥作用。例如，tRF- 1001即为一条来源于丝氨酸tRNA前体的tRF，由核酸内切酶elaC Z2切割tRNA前体生成。功能研究表明，tRF- 1001能够促进多种肿瘤细胞的增殖[20]。

值得注意的是，tRF分子无论是加工成熟过程还是作用机制，都和miRNA存在相似之处。有些在前期被确认为miRNA的分子，在后续研究中发现其来源于tRNA，被称为tRNA来源的小RNA(tRNA-derived small RNA，tsRNA)，其本质仍为tRF。在慢性淋巴细胞白血病、肺癌、前列腺癌等肿瘤中，tsRNA发生特征性的表达谱改变，提示tRF在功能上也和miRNA类似，具有癌基因或抑癌基因的活性[21- 22]。例如，CU1276是一条从人类成熟B细胞中克隆到的tRF分子，长度为22 nt，其被证实来源于多个tRNA的3’端序列。CU1276不仅长度和miRNA相似，其加工成熟过程也和miRNA类似，需要依赖Argonaute蛋白和DICER1蛋白。CU1276的作用机制也与miRNA相似，其通过序列特异性结合于mRNA 3’非翻译区的方式，抑制复制蛋白A1的表达。在功能调控方面，CU1276抑制细胞的增殖，参与DNA复制和损伤修复过程。在生发中心淋巴瘤细胞中发现CU1276表达缺失，造成细胞增殖加速及DNA代谢动力学的紊乱[23]。作为tRF的另一个实例是miR- 3676和miR- 4521，这两条miRNA来源于苏氨酸tRNA的前体，属于3’tRF，其序列在慢性淋巴细胞白血病和肺癌中发生突变[21]。tRF在mRNA上的结合位点序列与一种RNA结合蛋白，即YBX1的结合位点序列相同。在乳腺癌细胞遭受缺氧等应激条件下，细胞内tRF被诱导而大量生成，并与YBX1竞争性结合癌基因mRNA的3’非翻译区位点，导致mRNA上的YBX1被tRF取代，其结果是癌基因mRNA加速降解。如果这类抑癌性的tRF生成减少，会导致该抑癌通路效应减低，乳腺癌细胞的转移活性增强[24]。

有些tRF也可能在非恶性肿瘤的病理情况下大量生成，如呼吸道合胞病毒感染后的人肺癌细胞系中，产生大量长度约30 nt的tRF分子，其中一条来源于tRNA-Glu-CTC的tRF能够促进呼吸道合胞病毒的复制[25]。此外，tRF也能干扰真核细胞的翻译起始因子，从而抑制蛋白的翻译[26]。

Ⅲ型超基因

一些基因位点既能直接生成不同的转录产物，其部分转录产物也能加工生成不同的RNA分子，即同时具备Ⅰ型和Ⅱ型超基因的特点，这类基因称为Ⅲ型超基因。该类型超基因的典型实例是H19基因位点，该位点的两个方向均可被转录，生成4种不同的RNA分子。其正向转录产物除lncRNA H19外，在人和小鼠细胞中，H19可作为miR- 675的前体，进一步加工生成成熟的miR- 675[27]。此外，H19基因反向转录亦可生成两条RNA，其中一条为lncRNA，作为H19的反向互补序列，该lncRNA被形象地命名为91H，即H19的反向拼写。另一条RNA可编码蛋白，被命名为H19反向肿瘤抑制基因(H19 opposite tumor suppressor，HOTS)。

H19基因位点的正向转录产物—H19/miR- 675H19基因启动子序列存在单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)位点，其中3个SNP位点与结直肠癌的风险和预后相关[28]。但这一调控机制对基因位点自身转录过程的影响还不明确。

该基因位点的转录产物lncRNA H19可在转录水平上对其他基因进行调控。H19与S腺苷蛋氨酸水解酶结合并抑制其功能，H19基因表达被抑制后，可使S腺苷蛋氨酸的水解加速，导致DNA甲基转移酶3β介导的多个基因的甲基化作用增强，从而影响细胞的功能[29]。

H19/miR- 675对细胞功能的调控更多发生在转录后水平。在不同的组织和细胞中，H19/miR- 675发挥的作用不同甚至可能相反[30- 31]。一方面，H19/miR- 675在畸胎瘤、结肠癌和肝癌等多种肿瘤细胞中具有抑癌基因的活性[32]。在前列腺癌细胞系中过表达H19可使miR- 675水平升高，导致miR- 675的直接靶基因TGFBI的表达被抑制，从而抑制前列腺癌的转移[33]。在非小细胞肺癌中，miR- 675的抑癌活性则是通过调控其靶基因GPR55实现的[34]。此外，在胚胎发育过程中，H19能够减缓细胞增殖，这一效应与伴随生成的miR- 675相关。在胚胎细胞中过表达miR- 675能够使增殖减慢，相关靶基因是胰岛素样生长因子1受体[35]。

另一方面，在乳腺癌等肿瘤中，H19/miR- 675具有癌基因活性。过表达H19/miR- 675能够促进乳腺癌细胞的增殖和转移，miR- 675靶定并调控c-Cbl和Cbl-b的表达，导致Akt和Erk通路持续活化，细胞的恶性程度增加[36]。在非小细胞肺癌中，H19诱导miR- 675表达升高，使miR- 675的靶基因p53过度抑制，导致肿瘤进程加速[37]。H19也可作为miRNA的吸附物，以竞争性内源RNA[38- 39]的方式调控其他基因的表达。例如，H19作为let- 7家族的生理性吸附物，能够调控肌组织的分化[40]。在乳腺癌细胞中，H19能够竞争性吸附miR- 200b/c和let- 7b，并促进这些miRNA的靶基因如Git2和Cyth3的表达，引起下游一系列细胞信号途径的改变，最终导致癌细胞的转移加速[41]。H19在食管癌细胞中也作为miR- 22- 3p的吸附物，抑制H19可使miR- 22- 3p的靶基因WNT1表达降低，从而抑制食管癌细胞的增殖和迁移，并增强癌细胞对放疗的敏感性[42]。

H19基因位点的反向转录产物—91H和HOTS蛋白根据目前的研究结果，作为H19的反向互补序列，lncRNA 91H在肿瘤中主要表现出癌基因的活性。例如在结肠癌细胞中，91H的表达水平上调，其通过调控靶基因HNRNPK促进癌细胞的转移，且91H在血清中的表达水平能够作为结肠癌预后的预测指标[43- 44]。在乳腺癌细胞中，91H促进细胞增殖、迁移和侵袭，其作用机制是抑制H19基因位点的甲基化，从而上调lncRNA H19的表达水平[45]。这一过程提示，该基因位点不同转录产物之间可能存在协同作用。H19基因位点的另一个反向转录产物HOTS是蛋白编码基因，值得注意的是，其编码产物具有抑癌活性，能够抑制横纹肌肉瘤、绒毛膜癌、肾母细胞瘤(Wilms瘤)等肿瘤细胞的生长[46]。

综上，H19基因位点的各转录产物在肿瘤细胞中的作用并不一致，各产物之间可能存在协同作用或拮抗作用，但其相互作用的具体机制目前还不十分清楚，有待进一步研究。

总 结

传统观点认为，原核生物的基因为多顺反子，即多数基因根据功能的相关性，成簇串联形成操纵子，受到统一的调控。与之对应，真核生物的基因为单顺反子，即一个基因通过转录仅生成一条RNA分子，并编码一条多肽链。但近年来的研究表明，真核生物的一个基因也可能通过不同的转录起止位点，或经过转录后剪切过程，生成不止一个RNA转录本，即所谓的超基因。这一观点的提出对真核生物单顺反子的理论进行了挑战，这是因为早期对非编码RNA的研究很少，主要关注编码基因，而编码基因大多数符合单顺反子的特征。近年随着非编码RNA的逐渐深入，越来越多的非编码RNA的转录特征被明确，发现很多非编码RNA是伴随编码基因的转录而生成的，甚至有些超基因位点并不包含编码基因，仅由长链非编码RNA(如lncRNA)和短链非编码RNA(如miRNA)构成。尽管如此，目前对于超基因的研究还处于初级阶段，在未来的研究中需要关注的不仅是超基因各RNA是如何转录的，而应该探索各转录本的表达如何进行协同调控，以及RNA转录本通过何种调控机制剪接生成多个RNA产物。超基因这种转录模式在细胞功能学调控方面的意义，也需要进一步阐明。随着研究的深入，超基因这种基因表达的“多面手”将更多地被阐释，隐藏在生物遗传密码当中的奥秘也将越来越多地被揭示。