DNA甲基化在免疫型复发性流产中的研究进展①

贾紫千 冯晓玲 李娜 张杨 蒋莎（黑龙江中医药大学，哈尔滨150040）

复 发 性 流 产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指孕妇在妊娠20周前，连续发生2次或2次以上的自然流产，发病率约为2%~4%［1］。导致RSA发病的原因复杂，其中约一半的RSA夫妇不能被明确诊断，称为不明原因复发性流产（unexplained recurrentspontaneous abortion，URSA）。正常妊娠的建立需要母体对胚胎半同种异体抗原产生免疫耐受，以防止母体免疫系统对胚胎产生免疫攻击，而引发流产［2］。这种免疫因素造成的RSA与母体自身抗体及母体免疫耐受失衡有关，其中后者与URSA关系密切。母胎界面上的免疫细胞对维持母胎免疫耐受平衡起关键作用［3］。DNA甲基化为广泛存在的表观修饰方式，异常的DNA甲基化可影响免疫细胞的增殖、分化及凋亡，而介导多种免疫性疾病的发生与发展［4］。因此，DNA甲基化可通过调控母体自身抗体及免疫细胞功能介导RSA的发生。

1 DNA甲基化

DNA甲基化属于一种动态的表观遗传修饰，是甲基化与去甲基化平衡的过程，其在决定哺乳动物细胞发育、谱系识别和转录调控方面发挥重要作用［5］。DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶（DN‐MT1、DNMT3A、DNMT3B）的催化，将活化的甲基添加到第5个碳位置CpG二核苷酸的胞嘧啶上，最终形成5-甲基胞嘧啶产物（5-methylcytosine，5-mC）的过程［6］，其可引起DNA构象改变，从而影响机体免疫相关基因及细胞因子的转录与表达。DNA甲基化的异常可表现为甲基化缺陷、高甲基化及甲基化酶高表达。DNA低甲基化促进基因转录，使免疫细胞异常活跃，免疫功能紊乱。哺乳动物的DNA甲基化动态过程大体都表现出生殖细胞高甲基化、胚胎低甲基化［7］。着床发育过程DNA甲基化的缺陷可导致胚胎发育障碍及胚胎死亡，高甲基化可引起胚胎细胞基因突变［8］。在胚胎发育过程中，DNA甲基化转移酶是促进细胞分化的必需酶，DNMT1的主要作用是通过DNA的复制来维持甲基化水平，研究认为DNMT1的紊乱可引起绒毛组织中DNA甲基化水平降低，是导致早期妊娠失败的原因［9］。而DN‐MT3A和DNMT3B称为从头甲基化，是将未发生甲基化的CpG催化出新的甲基化位点，可促进蜕膜细胞、滋养细胞的分化与增殖及胚胎的发育［10］。

2 DNA甲基化在免疫型RSA中的作用

免疫因素导致的RSA可分为母体自身抗体对胚胎产生排斥反应的自身免疫型RSA，以及母胎界面中母体免疫耐受功能失衡，无法识别来自父系的胚胎抗原呈现低免疫反应，引起母体封闭抗体阴性而攻击胚胎的同种免疫型RSA。

2.1 在自身免疫型RSA中的作用自身免疫型RSA可因母体患有某种自身免疫性疾病，而产生特定的抗体，排斥胚胎着床及发育，包括组织非特异性自身抗体及组织特异性自身抗体。

2.1.1 组织非特异性自身抗体组织非特异性自身抗体包括抗磷脂抗体（antiphospholipid antibody，aPL）、抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）及抗DNA抗体等。aPL又包括抗心磷脂抗体（anticardio‐lipin antibody，ACA）、狼疮抗凝因子、抗β2糖蛋白1（β2GP-1）抗体。ACA阳性是导致RSA发病最主要的原因，ACA可通过胎盘血管内皮竞争性结合磷脂受体，损伤胎盘血管内皮，使胎盘形成血栓，导致蜕膜与胎盘供血不足、胎盘栓塞梗死，造成妊娠失败［11］。约20%的RSA患者合并有抗磷脂抗体综合征（antiphospholipid antibody syndrome，APS）［2］。有研究发现，抗β2GP1-CXCL4抗体复合物可激活内皮细胞释放促炎和促凝血因子形成APS模型，激活DNMT3B、TET1、HDAC9等甲基转移酶表达，可影响APS患者白介素8（interleukin-8，IL-8）启动子和组织因子（tissue factor，F3）第一内含子的表观遗传修饰的改变，其中IL-8启动子甲基化可作为APS的鉴别因素或临床表现，IL-8和F3甲基化水平的差异预示了血栓形成前的炎症过程［12］。ANA和抗DNA抗体多在系统性红斑狼疮及类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中呈阳性，其引发RSA的机制尚不明确，抗DNA抗体与RSA的关系尚存争议。目前认为ANA导致的RSA可能是由于感染因素，导致子宫内膜炎症的发生，使胚胎不能植入；或血液中的ANA免疫复合物沉着于蜕膜血管组织中，影响胎盘发育，造成早期妊娠丢失［13］。有研究发现患有自身免疫性疾病的患者T细胞中含有低甲基化的DNA和类似的自身免疫性T细胞亚群，认为DNA甲基化的缺陷是自身免疫性疾病的发病原因［14］。

2.1.2 组织特异性自身抗体组织特异性自身抗体包括抗精子抗体（antisperm antibody，AsAb）、抗卵巢抗体（anti ovarian antibody，AoAb）、抗子宫内膜抗体（endomethal antibody，EmAb）、抗甲状腺抗体（antithyroid antibody，ATA）等。AsAb可通过干扰精子获能及顶体反应阻碍受精卵的形成，同时激活巨噬细胞形成，杀伤精子或受精卵，从而造成早期流产。热休克蛋白（heat shock proteins，HSP）可与人类AsAb发生反应，阻止受精，HSPA1L启动子的DNA甲基化降低，可使该蛋白含量上调，则含有HS‐PA1L的精子更容易被杀伤［15］。AoAb的产生代表自身免疫功能的紊乱，卵巢受到感染产生抗体，而影响卵巢功能，抑制卵子排出，使卵巢内分泌功能紊乱，着床后卵巢分泌的雌孕激素不足，进而导致RSA的发生。DNMT存在于卵母细胞中，随着卵母细胞的生长到胚胎的植入，呈现动态的增加，DNMT的缺陷会导致卵母细胞成熟受损、胚胎死亡及异常基因表达相关的综合征，如免疫功能异常［16］。Em‐Ab的形成可由于子宫内发生炎症反应，从而激活子宫内膜组织抗原形成抗体，受损的子宫内膜可影响胚胎的植入或发育，引起流产。研究发现反复胚胎植入失败的妇女子宫内膜的网蛋白表达下调，在整个月经周期中，子宫内膜中的甲基化谱是发生变化的，在子宫内膜甲基化的基因组调控下，可影响子宫内膜生物学的改变［17］。妊娠早期正常的生理变化，如血浆血量增加、碘浓度降低、甲状腺结合球蛋白产生增加，都可导致妊娠期间对甲状腺激素的需求增加，当RSA患者免疫功能紊乱，血清ATA含量升高，高表达的ATA引起胎盘反应性增高，致使胎盘功能降低，发生流产［18］。经研究证实甲状腺功能亢进患者的T淋巴细胞和B淋巴细胞整体呈低甲基化趋势，DNMT1的表达也普遍偏低［19］。

2.2 在同种免疫型RSA中的作用母胎界面属于独特的免疫位点，可耐受半同种异体的胎儿，并维持宿主对病原体的防御。同种免疫型RSA的发生是母体免疫细胞与来自滋养层及蜕膜中的胎儿免疫细胞之间的免疫耐受不平衡导致的，包括固有免疫紊乱和获得性免疫紊乱。胚胎的植入过程表现为一种促炎状态，妊娠的维持需要母胎间各类细胞因子处于平衡［2］。

2.2.1 固有免疫固有免疫属于自然的免疫反应，固有免疫应答的细胞可永久性的存在于母胎界面，寻找可威胁妊娠的外来抗原。胎盘及蜕膜是固有免疫应答的重要组成部分，蜕膜可合成各种趋化因子，包括自然杀伤（natural killer，NK）细胞、巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cells，DCs）及补体系统等。

2.2.1.1 NK细胞蜕膜NK细胞可促进血管生成和滋养层的入侵，与胎盘的发育密切相关。正常妊娠者外周血NK细胞含量在受精卵植入后呈下降趋势，RSA患者外周血中NK细胞CD56+/CD16+升高，可损伤妊娠组织，导致RSA［20］。有研究发现DNA甲基化的变化与人类NK细胞活化程度相关，活化的NK细胞可导致CpG低甲基化，已知的DNA甲基化调节的免疫位点也在活化的NK细胞（如TNF-α、LTA、IL-13、CSF2）中发现。活化的NK细胞处于高度去甲基化状态，而原始NK细胞处于低去甲基化状态，说明NK细胞的甲基化具有可塑性和重塑性［21］。提示随着受精卵的植入到胚胎的形成，NK细胞表达升高导致的DNA去甲基化过程异常，可能是RSA的发病原因。

2.2.1.2 巨噬细胞巨噬细胞属髓样免疫细胞，主要分为两种类型：M1型具有杀菌和促炎功能，M2型具有免疫调节功能。受精卵着床前，蜕膜巨噬细胞向M1型极化，被认为是人类胚胎和子宫内膜间活跃的介质，可调节炎症反应，使肿瘤因子表达升高［22］。在胚胎植入后，蜕膜基质中的M2型巨噬细胞显著增加，使T淋巴细胞活跃，吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）高表达，保护胎盘及胎儿的发育，当胎盘发育结束，蜕膜巨噬细胞表达开始下降［23］。研究认为母胎界面上强烈的促炎反应可能不利于妊娠的维持，而DNA甲基化有助于母胎界面上的巨噬细胞发挥抗炎作用，且母体细胞与胎儿细胞的DNA甲基化存在显著差异，与免疫应答相关的甲基化多在胎儿细胞中呈高表达［24］。SPINELLI等［25］通过实验发现，人类IDO1基因甲基化异常的改变与流产的发生有关，妊娠期间抑制IDO1的活性可导致胎儿死亡，对早期流产的整倍体胎盘分析显示呈高甲基化表达。

2.2.1.3 DCs DCs被称为有效的抗原提呈细胞，在免疫应答过程中具有诱导抗原特异性激活和抑制的独特能力，DCs可激活NK细胞，调节T淋巴细胞分化及Th细胞平衡，存在于非妊娠子宫、子宫内膜、胎盘和蜕膜中［22，26］。DCs在蜕膜基质细胞中含量较低，但具有识别胎儿抗原的能力，在调节活化的母体T细胞中起重要作用。着床时子宫内的DCs可能是对胎儿最大的免疫威胁，随着胚胎的植入，迁移的DCs在蜕膜基质中生长，并通过基质细胞衍生因子及其受体调节蜕膜血管的生成和血管扩张，从而促进胎盘的形成及胚胎的发育［27］。调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是蜕膜组织免疫耐受所需要的抑制性CD4+T辅助细胞的一个子集，正常妊娠人类的外周血Treg数量呈上升趋势，蜕膜组织中Foxp3+Treg水平的降低是导致流产发生的原因，而DCs可促进效应T细胞中Foxp3位点呈低甲基化状态，使母胎界面免疫功能紊乱，发生RSA［28-29］。

2.2.1.4 补体系统补体系统（complement sys‐tem，CS）为多种自身免疫性疾病的发病机制，在缺血/再灌注过程中导致多种炎症驱动，而造成组织损伤。正常妊娠期间，CS在母胎界面上被激活，若胎盘中补体激活过多可能存在胎盘损伤及胎儿死亡的风险，因此在胎盘中保持CS的平衡非常重要。人体中补体C3含量最高，来源于胎盘，为胚胎营养因子，是CS的枢纽，可介导补体系统激活，对妊娠早期胎盘的发育起重要作用［30］，但若其含量过高，引起补体系统过度激活，是导致免疫型RSA发生的原因。有研究发现C3基因体中有明显的高甲基化CpG区，从而激活CS，使过多的补体在胎盘中沉积，诱导免疫性损伤，形成血栓前状态，抑制胚胎发育，与RSA关系密切［31］。

2.2.2 获得性免疫获得性免疫是后天机体免疫系统受到病原体及有毒代谢产物等抗原刺激后，产生特异性抗体的识别及防御能力，促进免疫应答。Treg的异常表达、辅助性T细胞（T help cell，Th）的失衡及封闭抗体（blocking antibodies，BA）的缺失都是引起获得性免疫功能紊乱，导致RSA的发病机制。

2.2.2.1 Treg Treg可分为来源于胸腺的天然Treg（nTreg）及在外周由幼稚细胞诱导的适应性Treg（iTreg），nTreg有助于抑制免疫排斥，而iTreg的免疫调节能力相对较弱，nTreg的标志物CD4+CD25+Treg的低表达能够破坏免疫耐受［32］。妊娠期Treg主要集中于母胎界面，蜕膜T细胞可调节胎盘微环境并识别胎儿抗原，防止免疫排斥，促进胚胎植入［33］。Treg的缺陷是导致反复胚胎植入失败或胚胎停育，形成RSA的原因。Treg的缺陷是由机体转录因子Foxp3突变或缺失引起的，nTreg的发育不仅需要Foxp3的表达，还需要建立nTreg型CpG的低甲基化模式［34］。胚胎植入的过程相当于炎症反应，有研究证实肿瘤坏死因子受体2（tumor necrosis factor receptor2，TNFR2）在炎症条件下表达，TNFR2可通过限制Foxp3启动子的DNA甲基化来诱导Treg，并激活DC调节其功能［35］。因此Foxp3的正常表达及nTreg DNA低甲基化，对于妊娠的维持至关重要。

2.2.2.2 辅助性T细胞Th根据功能不同可分为Th1、Th2及Th17［36］。Th1主要参与外周组织器官特异性自身免疫性疾病的发生，促进免疫排斥反应，是造成RSA的潜在原因。Th2参与抗炎反应，可减少胚胎毒性的分化，调节免疫应答，抑制Th1的分化功能［37］。因此，正常妊娠的建立，母胎界面细胞因子需要偏于Th2的表达。Th17可产生一系列促炎细胞因子和宿主防御因子，在预防妊娠期病理感染中发挥重要作用［2］。Th17异常表达，与胎儿丢失有关，可能导致RSA［38］。有研究发现正常妊娠前期Th2通路基因甲基化水平的变化更为频繁，而在妊娠后期Th1通路CpG甲基化水平的变化较频繁，因此Th1与Th2基因甲基化变化的情况与妊娠的维持相关［39］。YANG等［40］对CD4+T细胞分泌的Th1和Th17 DNA甲基化水平的变化进行了全面分析，相比于Th1，Th17 DNA去甲基化区域的数量更多，与nTreg有更大的重叠。

2.2.2.3 封闭抗体BA是因胚胎同种半异体移植物刺激人类白细胞（human leukocyte antigen，HLA）、滋养细胞及淋巴细胞等抗原与母体免疫系统反应所产生的一类保护性IgG抗体，其可阻断母体免疫系统对胚胎的攻击。BA的缺乏或水平较低，可影响母体免疫应答，是导致URSA发生的主要原因。HLA-G基因主要在妊娠期母体胎盘细胞中表达，该基因编码多种亚型，可在整个母胎界面上完成多种功能，HLA-G蛋白水平的降低是妊娠失败的原因，-725G等位基因的甲基化可抑制HLA-G转录，下调HLA-G蛋白表达，致使胚胎丢失［41］。

3 结语

成功的妊娠离不开各种免疫因素间的动态平衡，母体自身免疫抗体的产生及母胎界面间的免疫调节失衡，都是影响胚胎植入，导致RSA发生的原因。DNA甲基化的异常不但与多种免疫性相关疾病的发生有关，又可通过影响母胎界面的免疫耐受，引起母体免疫系统对胚胎产生防御性排斥反应。DNA甲基化作为表观遗传修饰领域中最具前景及敏感性的生物学标志物，其在肿瘤学中研究广泛，认为DNA甲基化的发生早于基因突变，并可直接从组织中获取相关遗传物质，对疾病进行预防及治疗。免疫型RSA与肿瘤的发病机制类似，都表现为各类免疫细胞异常的表达而对免疫应答产生抑制作用。相信随着对表观遗传学研究的深入，可以进一步探索出DNA甲基化对免疫型RSA的靶向诊断及精准治疗，以促进生殖医学更快的发展。