抗破伤风类毒素单克隆抗体的制备与鉴定①

董国霞 张华捷 晁哲 田霖 侯启明 谭亚军 马霄（中国食品药品检定研究院百白破疫苗和毒素室，卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京102629）

破伤风疫苗是预防破伤风的有效途径，破伤风类毒素是破伤风疫苗的主要有效组分，破伤风疫苗效价检测是疫苗有效的重要指标。本研究拟通过抗破伤风类毒素单克隆抗体的制备为破伤风疫苗效价检测新方法的建立、低含量破伤风类毒素测定、吸附度测定等奠定基础，以提升我国破伤风疫苗质量控制水平。

1 材料与方法

1.1 材料破伤风类毒素由本室提供；HRP标记的羊抗鼠二抗为Invitrogen产品；石蜡油为MP Bio‐medical产品；DMEM培养液、胎牛血清为Gibco产品；G蛋白柱为GE Healthcare产品；超滤管为Milli‐pore产品；96孔聚苯乙烯酶标板为Greiner Bio-One GmbH产品；抗体亚类鉴定试剂盒为Proteintech产品；其他常用试剂均为国产分析纯；SP2/0骨髓瘤细胞由本室保存；BALB/c小鼠、昆明小鼠由中国食品药品检定研究院实验动物生产与供应室提供。3K30高速冷冻离心机为Sigma产品；5810R低速离心机为Eppendorf产品；AKTA层析系统为Amer‐sham pharmacia biotech产 品；Biacore T200为GE Healthcare产品；酶标仪为Bio-Tek产品；电泳仪为Bio-Rad产品。

1.2 方法

1.2.1 抗破伤风类毒素单克隆抗体的制备及纯化［1-2］选择纯度较好的破伤风类毒素抗原对BALB/c雌性小鼠进行免疫，按常规方法将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，把筛选后获得的阳性杂交瘤细胞株进行扩种、保存。取BALB/c雌性小鼠，每只腹腔注射0.5 ml石蜡油，10 d后每只小鼠腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，注射1周后收集腹水，3 000 r/min离心20 min，收集中间层，-20℃冻存。用AKTA层析系统和Protein G柱对收集的中间层进行纯化。

1.2.2 单克隆抗体的效价检测［3］用破伤风类毒素包被96孔酶标板，4℃孵育过夜，洗板后第一行加入稀释的单克隆抗体，倍比稀释至第8行，37℃孵育1 h，洗板后加入过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，洗板后加入OPD显色液，孵育10 min，在波长490 nm/630 nm处用酶标仪检测其OD值。以P/N≥2.1的抗体最大稀释度作为其抗体效价。

1.2.3 单克隆抗体的亚类鉴定用Proteintech抗体亚类鉴定试剂盒按其说明书操作步骤对单克隆抗体进行亚类检测。

1.2.4 单克隆抗体的亲和力测定利用Biacore T200检测单克隆抗体与破伤风抗原的亲和力数据。按Mouse Antibody Capture Kit说明书通过氨基偶联法固定鼠源抗体至CM5芯片上，加入合适浓度的破伤风抗原，分别与不同单克隆抗体进行结合再解离，所得传感图利用其分析软件进行拟合，获得抗体与抗原的亲和力数据。

1.2.5 单克隆抗体的蛋白浓度测定用NanoDrop 2000分光光度计的Protein A280进行单克隆抗体的蛋白浓度检测。

1.2.6 单克隆抗体的纯度分析［4］将纯化的单克隆抗体用SDS-PAGE电泳进行纯度分析。

1.2.7 单克隆抗体的特异性分析［5-6］用破伤风类毒素（T）、白喉类毒素（D）、百日咳毒素（PT）、百日咳丝状血凝素（FHA）和百日咳黏附素（PRN）分别包被酶标板，4℃孵育过夜，洗板后各包被抗原分别加入T1、T2、T3、T4、T5单克隆抗体，同时设阳性对照、阴性对照，之后同1.2.2中操作。

1.2.8 单克隆抗体的中和活性分析［7］按2015版药典破伤风抗毒素效价测定法测定单克隆抗体的中和活性。试验分别设样品组、标准组、毒素组和空白组；样品组中昆明小鼠注射T1、T2、T3、T4、T5单克隆抗体各稀释度与毒素中和后的溶液及T1、T2、T3、T4、T5单克隆抗体混合后各稀释度与毒素中和后的溶液（分别为T1样品组、T2样品组、T3样品组、T4样品组、T5样品组和T6样品组），样品组分为3个不同的稀释度；标准组中昆明小鼠注射破伤风抗毒素标准品与毒素中和后的溶液；毒素组中昆明小鼠只注射稀释后的毒素溶液；空白组中昆明小鼠只注射缓冲液；注射后连续5 d观察小鼠存活情况。

1.2.9 杂交瘤细胞株稳定性检测T1、T2、T3、T4、T5杂交瘤细胞株在液氮罐冻存2个月及13个月后各复苏1次，检测复苏后细胞培养上清效价；并在13个月解冻后连续培养传至20代，每5代检测1次细胞培养上清效价，以检测杂交瘤细胞的活性和分泌抗体的稳定性。

2 结果

2.1 制备及纯化抗破伤风类毒素单克隆抗体通过制备、纯化获得T1、T2、T3、T4、T5共5个抗破伤风类毒素单克隆抗体。

2.2 效价检测检测T1、T2、T3、T4、T5单克隆抗体的腹水效价为1∶1.60×106～1∶1.28×107，纯化后其效价为1∶3.20×106～1∶1.28×107，见表1。

表1 腹水及纯化单克隆抗体效价（McAbs）Tab.1 Titer of ascites and purified monoclonal antibodies（McAbs）

2.3 抗破伤风类毒素单克隆抗体的亚类鉴定用抗体亚类鉴定试剂盒对5株单抗进行鉴定，结果表明5株单抗分别为IgG1、IgG2b亚类，轻链均为к型，如表2所示。

表2 抗体亚类鉴定Tab.2 Identification of antibody subclass

2.4 单克隆抗体的亲和力测定通过Biacore检测单克隆抗体与破伤风类毒素的亲和力，见图1～5，T1、T2、T3、T4、T5单克隆抗体与破伤风类毒素的亲和力数据分别为5.455E-9 M、2.074E-8 M、2.050E-9 M、2.021E-9 M和1.295E-9 M。

图1 T1单抗结合动力学曲线Fig.1 Binding dynamics curve of T1 McAb

2.5单克隆抗体的蛋白浓度测定通过NanoDrop 2000分光光度计Protein A280检测抗破伤风类毒素单克隆抗体T1、T2、T3、T4、T5的蛋白浓度分别为：15.126 mg/ml、5.772 mg/ml、12.278 mg/ml、12.58 mg/ml和16.301 mg/ml。

图2 T2单抗结合动力学曲线Fig.2 Binding dynamics curve of T2 McAb

图3 T3单抗结合动力学曲线Fig.3 Binding dynamics curve of T3 McAb

2.6 单克隆抗体的纯度分析将纯化的单克隆抗体用SDS-PAGE电泳进行纯度分析，电泳结果显示各单克隆抗体具有较好的纯度，分子量在预期范围内，见图6。

图4 T4单抗结合动力学曲线Fig.4 Binding dynamics curve of T4 McAb

图5 T5单抗结合动力学曲线Fig.5 Binding dynamics curve of T5 McAb

图6 单克隆抗体的SDS-PAGE电泳Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis of McAbs

2.7 单克隆抗体的特异性分析采用ELISA法对T1、T2、T3、T4、T5单克隆抗体的特异性进行分析，检测结果见表3，从表中可以看出T1、T2、T3、T4、T5单克隆抗体与T抗原具有较好的反应，而与百白破疫苗中的D抗原、PT抗原、FHA抗原和PRN抗原无交叉反应，说明T1、T2、T3、T4、T5单克隆抗体均具有较好的特异性。

表3 ELISA法对单抗的特异性分析Tab.3 Specific analysis of monoclonal antibodies by ELISA

2.8 单克隆抗体的中和活性分析注射后小鼠存活情况如表4（表中T1-1为低稀释度，T1-2为中稀释度，T1-3为高稀释度，下同）。标准组小鼠在注射后24 h均存活，无发病症状，24 h之后开始发病，第5天时全部死亡。空白组和T6样品组各稀释度小鼠在注射后5 d内均存活，且无症状。毒素组和T2样品组小鼠在注射后16 h全部死亡。T1、T3、T4、T5样品组在注射16 h后均有小鼠存活，T1-1有1只小鼠存活，T1-2、T1-3小鼠均死亡，由于T1-1仅有1只小鼠存活，不能确定其是否为中和性抗体；T3-1组的3只小鼠均存活，T3-2、T3-3小鼠均死亡，判断其为中和性抗体；T4样品组低、中稀释度无小鼠存活，而高稀释度有1只小鼠存活，但发病症状明显；T5样品组各稀释度均有小鼠存活，T5-1、T5-2、T5-3的小鼠分别存活3只、2只、1只，随稀释度由低到高小鼠存活呈一定梯度，24 h时T5-1的3只小鼠仍存活，T5-2、T5-3的小鼠均死亡，判断其为中和性抗体。

表4 各组小鼠存活情况Tab.4 Survival numbers of mice in each group

2.9 杂交瘤细胞株稳定性检测稳定性检测如表5，结果显示杂交瘤细胞株在冻存2个月、13个月后复苏及连续培养20代后，细胞上清效价未见明显变化，表明其均能分泌特异性抗体，且分泌能力基本保持不变。

表5 杂交瘤细胞株分泌抗体稳定性检测Tab.5 Stability test of antibodies secretion by hybridoma cell strains

3 讨论

辛酸-硫酸铵盐析和G蛋白亲和层析是纯化单克隆抗体时常用的两种方法，本课题组曾用两种方法分别对单克隆抗体进行纯化，辛酸-硫酸铵盐析法成本低，一次可进行大量样品的纯化，但回收率远低于文献报道的39%～90%［2，8-10］，可能与不同抗体类型及不同来源的样品有关，G蛋白亲和层析法纯化后单克隆抗体的回收率和纯度均较好，因此本研究采用G蛋白亲和层析柱进行纯化。

本研究纯化的T3、T5单克隆抗体对破伤风毒素具有中和作用，当把5个单克隆抗体混合后显示了更强的毒素中和作用，其与破伤风毒素的作用有待进一步研究。

破伤风疫苗效价是保证疫苗能有效预防疾病的重要指标，当前我国吸附破伤风疫苗效价检测采用的是小鼠和豚鼠攻毒法［7］，所用动物量较大，检测结果易受动物个体差异影响，且检测成本高、工作量大、有接触毒素的生物安全风险，不符合“减少、替代、优化”的3R动物使用原则。针对当前效价检测方法的不足，本研究拟通过破伤风单克隆抗体的制备，将其用于破伤风抗体体外结合ELISA检测方法中，为建立破伤风疫苗效价检测新方法奠定基础，实现用同一批动物血清同时检测破伤风、白喉等多种抗体，尤其是随着越来越多多联多价联合疫苗的出现，将大大减少动物的使用量、工作量和实验成本，提升我国吸附破伤风疫苗效价检测水平。本研究成功制备了5个破伤风单克隆抗体，其可用于破伤风疫苗效价检测新方法的建立、破伤风类毒素含量测定和吸附度测定等。