MAIT在Graves病中的免疫作用研究①

黄欣 李欣怡 李成文（西南医科大学基础医学院，泸州646000）

Graves病（Graves disease，GD）又称为毒性弥漫性甲状腺肿，是碘充足国家甲状腺功能亢进的最常见原因，约占全部甲状腺功能亢进症的80%以上，影响0.5%~2.0%的人口［1-2］。未矫正的甲状腺功能亢进症患者死亡风险增加，心血管疾病发病率高，包括心律失常，中风和心力衰竭［3］。甲状腺相关自身抗体的异常分泌是该病最突出的免疫学特征。促甲状腺素受体抗体（thyrotrophin receptor anti‐body，TRAb）是与GD最密切的甲状腺相关自身抗体，几乎在每个该病患者中都可检测到，但TRAb异常分泌的免疫学调控机制仍未完全明确。目前GD治疗方法主要包括131I治疗，抗甲状腺药物治疗等，131I治疗有效率高，但易发生甲减副作用不可逆，抗甲状腺药物治疗治愈率低、易复发［4-6］。

黏膜相关恒定T细胞（mucosal-associated invari‐ant T，MAIT）是最新发现的一种非传统T淋巴细胞。文献报道，MAIT促进炎症和肠道失调，导致肥胖期间的代谢功能障碍，促进T1D的发展，也参与了自身免疫性肝病中肝脏纤维化和SLE的发病［7-10］。也有文献报道MAIT参与了抗SARS-CoV-2和抗带状疱症病毒的免疫应答［11-13］。但目前尚无研究报道MAIT在GD中的免疫学作用。本研究初步探讨了MAIT在GD中的免疫学作用，拟为GD的免疫治疗提供新靶点。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料GD患者为2019年5月至2020年6月期间在西南医科大学附属医院核医学科和内分泌科就诊患者。收集30例GD初治患者为治疗前组，男、女各15例，平均年龄44.62岁；其中19例131I治疗3个月后的GD患者为治疗后组，男10例，女9例，平均年龄47.58岁；收集25例该院健康体检中心的健康体检者为对照组，男11例，女14例，平均年龄39.80岁。19例131I治疗3个月后的GD患者与治疗前为同一批患者。治疗后组纳入标准：符合《中国甲状腺疾病诊治指南》GD疾病诊断标准；自愿参加本试验，签署知情同意书，能遵守研究要求的患者。排除标准：肿瘤、传染病、妊娠期甲亢、炎症甲亢患者；T1D、SLE等自身免疫性疾病患者；近期内用过抗甲状腺药物、放射性碘等治疗患者；重要脏器严重受损者。该研究通过西南医科大学附属医院伦理委员会审批并按要求执行。3组临床资料比较见表1。

表1 3组临床资料比较Tab.1 Comparison of clinical characteristics among three groups

1.1.2 试剂APC-CY7-抗CD3、PE-抗CD161、PE-抗Human Invariant NKT（6B11）、APC-抗CD69、PECY7-抗IFN-γ、APC（AF647）-抗GrzB、Human BD Fc Block、Leukocyte Activation Cocktail、Human TGF-β、IFN-γ、IL-17A和IL-4 Flex set购自美国BD公司；LEGENDplexTMMul-Analyte Flow Assay Kit、percpcy5.5-抗TCR Vα7.2、PE-CY7-抗Annexin V、Zombie GreenTMFixable Viability Kit购自美国BioLegend公司；1640培养基购自Gibco公司；Recombinant Hu‐man IL-12p70购 自Pepro Tech公 司；Recombinant Human IL-18购自R&D Systems公 司；Ficoll-plaque plus购 自GE healthcare公 司；总RNA提 取 试 剂RNAiso Plus、逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标本制备采集健康志愿者及患者EDTA抗凝血，先分离血浆用于测定细胞因子，再用Ficollplaque plus分离余下外周血单个核细胞后计数，部分细胞用于提取总RNA后测定mRNA，剩余细胞冻存备用。

1.2.2 多色流式细胞染色PBMCs复苏后，按照抗体试剂盒使用说明书进行多色流失细胞染色再用流式细胞仪检测。

1.2.3 检测血浆细胞因子采用微量样本多指标蛋白定量技术（cytometric bead array，CBA）检测IFN-γ、IL-4、IL-17A和TGF-β，多细胞因子检测技术（LEG‐ENDplex）检测IL-12p70和IL-18，按照试剂说明书采用流式细胞仪快速测定待检血浆细胞因子。

1.2.4 细胞因子mRNA检测

1.2.4.1 总RNA的提取用氯仿提取总RNA，测量OD260/OD280和样品浓度并用琼脂糖电泳检测18 S和28 S条带的完整性。

1.2.4.2 反转录反应PCR仪中42℃反应2 min去除基因组DNA后，进行反转录，PCR反应条件：37℃15 min；85℃5 s；4℃保存。反应结束，将cDNA瞬时离心后冻存备用。

1.2.4.3 qRT-PCR定量检测mRNA反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s；60℃延伸30 s，循环40次。采用β-actin作内参基因，以公式ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（内参基因），ΔΔCt=ΔCt（实验组）-ΔCt（对照组均值）计算细胞因子基因相对表达量。

1.2.5 体外MAIT培养健康对照组和GD患者治疗前组PBMCs分别为刺激组和未刺激组，刺激组均加入IL-12p70（10 ng/ml）和IL-18（100 ng/ml），培养24 h后各组均分别取部分细胞检测细胞表面标志和细胞内细胞因子，剩余细胞继续培养96 h后流式细胞术检测各组凋亡率。

1.3 统计学处理由GraphPad Prism 7.0（Graph‐Pad软件）分析数据。正态分布、等方差的资料采用t检验或one way ANOVA进行组间比较；对于非正态分布的资料，采用Mann-WhitneyU检验或Kruskal-Wallis秩和检验进行比较，配对资料采用Wilcoxon配对符号秩和检验进行比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GD患者治疗前、后组外周血MAIT频率及表型和功能变化将CD3+TCR Vα7.2+CD161+的细胞认定为MAIT，检测3组外周血MAIT频率，与对照组相比，GD患者治疗前组MAIT频率显著降低（P<0.01）；治疗后组也显著降低（P<0.05）；与治疗前组相比，治疗后组MAIT频率轻度升高（P>0.05，图1）。

图1 健康对照组和GD患者治疗前、后组MAIT频率Fig.1 Frequency of MAIT of healthy controls，GD pa⁃tients of before treatment and GD patients of after treatment

检测3组外周血MAIT的表面标志和胞内细胞因子结果，与对照组相比，GD患者治疗前组CD69水平显著升高（P<0.000 1）；治疗后组也显著升高（P<0.001）；和治疗前组相比，治疗后组CD69轻度升高（P>0.05），图2A。经PMA和离子霉素刺激后，与对照组相比，GD患者治疗前组MAIT胞内IFN-γ水平显著降低（P<0.000 1，图2B），GrzB水平升高（P<0.05，图2C）；治疗后组MAIT胞内IFN-γ水平显著降低（P<0.001，图2B），GrzB水平显著升高（P<0.01，图2C）。与治疗前组相比，治疗后组MAIT胞内IFN-γ水平升高（P>0.05，图2B），GrzB水平升高（P>0.05，图2C）。

图2 健康对照组和GD患者治疗前、后组MAIT表面标志和胞内细胞因子频率Fig.2 Frequency of MAIT and their surface markers and intracellular cytokines in healthy controls，GD pa⁃tients of before treatment and GD patients of after treatment

将未治疗的GD患者外周血中FT3、FT4、TSH和TRAb的浓度与外周血中MAIT频率、表面标志、胞内细胞因子频率做相关性分析，发现TRAb的浓度与表达CD69的MAIT频率呈显著正相关（r=0.709 7，P<0.01，图3K），但其他指标之间无相关性（P>0.05，图3）。

图3 未治疗的GD患者外周血中甲状腺素、TRAb的浓度与外周血中MAIT频率、表面标志、胞内细胞因子频率的相关性Fig.3 Correlation between concentrations of thyroxine and TRAb in peripheral blood and frequency of MAIT，surface markers and intracellular cytokines of untreated GD patients

2.2 甲状腺中重度肿大患者外周血MAIT的频率与功能变化依据GD患者甲状腺的肿大程度，将甲状腺一度肿大的未治疗GD患者设为甲状腺轻度肿大组，甲状腺二度、三度肿大的未治疗GD患者分为甲状腺中重度肿大组，分析两组间MAIT频率、MAIT表面CD69的表达、胞内IFN-γ和GrzB分泌的差异。与健康对照组相比，中重度组MAIT的频率显著降低（P<0.01，图4A），CD69显著升高（P<0.001，图4B），IFN-γ水平显著降低（P<0.001，图4C），GrzB水平升高（P<0.05，图4D）；轻度组MAIT频率降低（P>0.05，图4A），CD69水平显著升高（P<0.01，图4B），IFN-γ水平显著降低（P<0.01，图4C），GrzB水平有所提高（P>0.05，图4D）。中重度组与轻度组相比，MAIT频率降低（P<0.05，图4A），CD69水平升高（P<0.05，图4B），IFN-γ水平降低（P>0.05，图4C），GrzB水平升高但无统计学意义（P>0.05，图4D）。

图4 健康对照组和GD患者不同病情程度中MAIT、表面标志和胞内细胞因子的频率Fig.4 Frequency of MAIT and their surface markers and intracellular cytokines in healthy controls and patients with different degrees of disease in GD patients

2.3 GD患者存在Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡为探索MAIT在GD中的免疫作用，检测了3组血浆细胞因子IL-4、IL-17A、IFN-γ、TGF-β含量。与对照组相比，GD患者治疗前组血浆IFN-γ显著升高（P<0.000 1，图5A），IL-4显著升高（P<0.01，图5B），IL-17A显著升高（P<0.000 1，图5C），TGF-β降低（P>0.05，图5D）；GD患者治疗后组IFN-γ显著升高（P<0.001，图5A），IL-4升高（P>0.05，图5B），IL-17A显著升高（P<0.00 1，图5C），TGF-β显著升高（P<0.000 1，图5D）。治疗后和治疗前组相比，治疗后IL-17A显著降低（P<0.01，图5C），TGF-β显著升高（P<0.000 1，图5D），IFN-γ降低（P>0.05，图5A），IL-4降低（P<0.05，图5B）。基因水平检测了外周血单个核细胞中IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、IL-17A mRNA和TGF-β mRNA的相对表达，结果与3组血浆中各种细胞因子蛋白表达水平一致。见图5E~H。

图5 健康对照组和GD患者治疗前、后组血浆中的IL-4、IL-17A、IFN-γ、TGF-β的 频 率 和PBMCs中IL-4 mRNA、IL-17A mRNA、IFN-γ mRNA、TGF-β mRNA的相对表达Fig.5 Frequency of IL-4，IL-17A，IFN-γ，TGF-β in plas⁃ma and relative expression of IL-4 mRNA，IL-17A mRNA，IFN-γ mRNA，TGF-β mRNA in PBMCs in healthy controls，GD patients of before treatment and GD patients of after treatment

2.4 GD患者MAIT的IL-12和IL-18激活途径及基础凋亡率检测检测三组血浆细胞因子IL-12p70和IL-18发现，与对照组相比，GD患者治疗前组IL-12p70升高（P<0.05，图6A），IL-18显著升高（P<0.01，图6B）；GD患者治疗后组IL-12p70升高（P<0.05，图6A），IL-18显著升高（P<0.000 1，图6B）。治疗后与治疗前相比，IL-12p70和IL-18轻度升高（P>0.05，图6A、6B）。基因水平检测了外周血单个核细胞中IL-12p70 mRNA和IL-18 mRNA表达，结果与蛋白水平检测结果一致，见图6C、D。

图6 健康对照组和GD患者治疗前、后组血浆中IL-12p70、IL-18频 率 和PBMCs中IL-12p70 mRNA、IL-18 mRNA的相对表达Fig.6 Frequency of IL-12p70，IL-18 in plasma and rela⁃tive expression of IL-12p70 mRNA，IL-18 mRNA in PBMCs in healthy controls，GD patients of be⁃fore treatment and GD patients of after treatment

GD患者治疗前组与对照组的PBMCs分别加IL-12p70和IL-18重组蛋白体外培养24 h后，治疗前组和健康人对照组MAIT表面CD69的表达，胞内IFN-γ和GrzB的产生均差异无统计学意义（P>0.05，图7A~C）。提示GD患者MAIT的IL-12和IL-18激活途径正常。

图7 健康对照组和GD患者MAIT的凋亡Fig.7 Apoptosis of MAIT cells in healthy controls and GD patients

检测治疗前GD患者组和对照组的基础凋亡率显示，治疗前GD患者凋亡率显著高于健康人对照组（P<0.001，图7D）。将GD患者治疗前组分为GD患者刺激组和GD患者未刺激组，对照组分为刺激组和未刺激组，将各组的PBMCs分别加IL-12p70和IL-18重组蛋白体外培养5 d后，结果显示对照刺激组凋亡率显著高于其未刺激组（P<0.05，图7E），GD患者刺激组凋亡率也显著高于其未刺激组（P<0.05，图7F），且对照刺激组培养5 d后，检测到MAIT的CD69表达显著高于未刺激组（P<0.01，图7G）。结果提示IL-12和IL-18促进了GD患者MAIT的活化和活化后凋亡。

3 讨论

研究报道表明MAIT既可致病也可治病［7-13］。目前尚无研究报道MAIT在GD中的免疫学作用。激活的MAIT主要通过分泌GrzB、IFN-γ和IL-17A发挥作用。文献报道体外培养的T1D患者的MAIT可能通过产生GrzB直接杀死胰腺β细胞，MAIT分泌的GrzB在局部抗结核免疫中也发挥重要作用［8，14］。GrzB具有诱导细胞凋亡的功能，极低浓度的GrzB即可杀伤细胞［15］。本研究发现，经离子霉素和PMA刺激培养后，与对照组比较，GD中重度组患者MAIT产生的GrzB显著增多，轻度组有升高趋势；GD治疗前和治疗后患者组MAIT产生的GrzB均显著升高；治疗后组与治疗前组比较，GrzB有升高趋势，图2C、3D，以上结果提示MAIT可能通过分泌GrzB杀伤甲状腺细胞发挥抗GD作用。

CD69是MAIT的活化标志。本研究发现GD治疗前组和治疗后组外周血中MAIT表达的CD69都显著高于健康人对照组；患者治疗后组与治疗前组比较，MAIT表达的CD69呈降低趋势，提示治疗有效。GD中重度组和轻度组患者MAIT表达的CD69均显著高于健康人对照组，且中重度组也显著高于轻度组。结果表明GD患者的MAIT处于活化状态，且甲状腺肿大程度越大活化程度越高，图2A、3B，提示MAIT可能参与了抗GD过程。同时还发现，未治疗的GD患者外周血中表达CD69的MAIT频率和TRAb浓度呈正相关。而TRAb浓度越大代表病情越重，即GD患者外周血中的TRAb浓度越大，病情越重，活化的MAIT越多，则会产生的更多的GrzB对甲状腺细胞产生杀伤作用，有利于减轻甲状腺功能亢进，进一步提示MAIT参与抗GD。

本研究发现，与对照组比较，GD患者轻度组外周血MAIT频率呈降低趋势，中重度组外周血MAIT频率显著降低，提示MAIT参与了抗GD作用。GD患者治疗后MAIT频率略高于治疗前，提示治疗有效；但治疗前和治疗后组外周血均显著低于对照组，可能由于一是GD患者外周血活化的MAIT分泌GrzB发挥抗GD作用后发生凋亡，因实验发现GD患者治疗前组MAIT凋亡率高于对照组，且两组MAIT都分别经IL-12p70和IL-18刺激培养后，刺激组的凋亡率均高于未刺激组，而且对照组刺激后MAIT表面CD69显著高于未刺激，提示高水平的IL-12p70和IL-18促进了GD患者MAIT的活化和活化后凋亡。二是GD患者外周血中MAIT可能迁徙到甲状腺局部参加抗GD，因有研究报道，类风湿性关节炎患者循环MAIT频率的减少是由于募集到了具有炎症的滑膜组织［16］。GD通常选用药物治疗或131I治疗，选择切除甲状腺组织治疗的患者很少，所以本研究未收集到GD患者甲状腺组织样本进行分析，尚存在不足。进一步研究可进行小鼠GD造模，取小鼠外周血以及甲状腺组织进行分析。

MAIT主要通过TCR-MR1-核黄素代谢物的经典激活途径和IL-12、IL-18旁路激活途径被激活［17］。未见研究报道GD患者体内存在微生物群的变化，因此GD患者外周血MAIT的表型、功能变化及MAIT丢失可能与MAIT的IL-12和IL-18途径激活有关。实验结果发现GD患者血浆IL-12和IL-18显著升高，IL-12p70 mRNA和IL-18 mRNA水平也显著升高，提示GD患者MAIT存在IL-12和IL-18激活途径。但将IL-12p70和IL-18刺激GD患者和健康志愿者外周血PBMC 24 h后，结果GD患者与健康对照组相比，MAIT表面CD69的表达以及胞内IFN-γ和GrzB均差异无统计学意义，提示GD患者MAIT的IL-12和IL-18激活途径正常。

IFN-γ是MAIT发挥作用的另一重要细胞因子。血浆中GD患者治疗前、治疗后组IFN-γ均显著高于健康对照组，治疗前升高是由于GD是自身免疫病，机体的免疫应答过强所致，治疗后升高可能是过强的免疫应答还未恢复到正常，也可能是免疫应答偏向Th1型，治疗后与治疗前相比，IL-4显著降低。但经离子霉素和PMA刺激培养后，GD中重度组和轻度组患者MAIT分泌的IFN-γ均显著低于健康对照组，且中重度组比轻度组有降低趋势，这与IFN-γ分泌越低，免疫应答越偏向于Th2型，病情越重相吻合；且刺激培养后治疗前和治疗后组MAIT分泌的IFN-γ均显著低于健康对照组，结果表明GD患者MAIT分泌IFN-γ功能受损，与文献报道一致，导致Th2型应答增强［13，16］；而治疗后组比治疗前组的IFNγ分泌有升高趋势，表明治疗有效，免疫应答偏向于Th1型。

本研究也发现，与健康对照组相比，GD患者治疗前组血浆中IFN-γ和IL-4均显著升高，且IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA均显著升高，提示GD患者体内的细胞免疫和体液免疫应答都显著增强；GD患者治疗后组IFN-γ显著升高，IL-4升高无统计学意义；且治疗后组与治疗前组比较，IFN-γ降低无统计学意义，而IL-4显著降低，这表明治疗后Th2应答减弱，偏向于Th1应答，提示GD患者中存在Th1/Th2失衡。与健康对照组相比，GD患者治疗前组血浆中IL-17显著升高，TGF-β则呈下降趋势，提示GD患者存在Th17/Treg失衡；治疗后组与治疗前比较，IL-17显著降低，TGF-β显著升高，提示Treg细胞抑制自身免疫和炎症反应，Th17/Treg趋向平衡，表明治疗有效。

总之，本研究发现GD患者治疗前、后组外周血MAIT均显著降低，活化标志CD69表达均显著升高，分泌的GrzB显著升高，且病情越重，MAIT降低越多，以上结果均提示MAIT发挥抗GD作用，IL-12和IL-18可能促进了MAIT的活化和凋亡。因此，检测GD患者MAIT的频率和功能有助于判断病情及为GD的免疫治疗提供新靶点。