一种新的抗生素联合用药方案清除细胞支原体污染的研究

黎 少 梁永康 冯思桦 彭 青 高 毅

支原体污染是细胞培养、基础研究和生物制品生产等主要问题[1-3]。虽然细胞培养物的支原体感染可能持续很长时间且没有显著的细胞损伤，不像其他细菌或真菌污染的明显可见性，但是却对细胞的代谢、增殖、活性等具有明显影响，影响相关实验结果的准确性[4-5]。支原体阳性细胞培养本身就是感染的主要来源，为了防止污染物扩散通常建议将阳性培养物丢弃并替换。如果认为培养物不可替代或丢弃，则需要采取可有效消除支原体污染的技术方法。近年来，已经采用了许多方法，包括抗生素使用、裸鼠体内传代或者软琼脂中培养等技术[6-7]。去除支原体污染较为费时，且具有污染复发的风险。因此，在去除支原体污染的过程中，使用方法应操作简便，对细胞生长的影响较小，且能保证细胞主要特征不丢失[8]。

抗生素处理已被证明是可靠、有效的方法之一，具有成本低、易操作、可控制等优点[9-10]。当前最常用于支原体清除的抗生素有四环素类、大环内酯类、喹诺酮类和酰胺醇类等，这些抗生素无论在临床应用和实验研究中均具有对抗支原体的效果[11-12]。不同类型的抗生素联合用药可能产生协同或增效作用，并有助于缓解抗生素耐药性的发生。因此，采用抗生素联合用药可能会提升支原体去除效果，同时抵抗支原体抗性的发展[13-14]。市场上也有许多清除支原体商品化试剂包括：BM-Cyclin(Roche)和Plasmocin(InvivoGen)等，都含有不同类别抗生素药物。BM-Cyclin含有泰妙菌素和米诺环素两种抗生素组合[8]。Plasmocin包含大环内酯类及喹诺酮类等抗生素药物[15]。上述试剂都是含有2种以上抗生素药物类型。基于此，我们通过已有文献报道，设计了一种新的抗生素联合药物处理方案，包含了红霉素、氯霉素、泰乐菌素和环丙沙星，成分清晰且作用机制明确。红霉素和泰乐菌素属于大环内酯类抗生素，氯霉素属于酰胺醇类抗生素，作用机制是通过核糖体50S亚基上的23S rRNA结合，抑制蛋白质的合成作用来发挥活性，干扰蛋白质合成；环丙沙星属于喹诺酮类抗菌药物，作用于支原体DNA复制关键酶，阻止DNA复制和修复等[16-18]。通过蛋白合成和DNA复制等不同作用机制，联合有效处理支原体污染，评价支原体清除后细胞功能情况，以此获得一种成分清晰，去除支原体效果佳的抗生素联合药物方案。

1 材料与方法

1.1 材料

红霉素、氯霉素、泰乐菌素购自上海陶素生化科技有限公司；Plasmocin购自 InvivoGen公司；乳酸环丙沙星氯化钠注射液购自广州南新制药有限公司；PCR引物合成于北京擎科生物科技有限公司；Premix Taq TM mix购自TaKaRa公司；DEPC水购自上海碧云天生物技术有限公司；支原体荧光检测试剂盒和总RNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；DNA marker，反转录试剂盒和预混型qPCR试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；DMEM高糖培养基和血清购自Gibco公司；SYBR Safe DNA Gel Stain和CCK8试剂购自ApexBio公司；琼脂粉购自Biowest 公司；二甲基亚砜DMSO购自MP Biomedicals 公司；二氧化碳培养箱和酶标仪购自Thermo Fisher Scientific公司；电泳仪和qPCR仪购自BIO-RAD公司；荧光显微镜购自Zeiss公司；倒置显微镜购自广州市明美光电技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和药物配制 C3A细胞为本实验室已有细胞，受到支原体感染，使用含10%胎牛血清的高糖培养基，置于二氧化碳培养箱中培养。红霉素、氯霉素、泰乐菌素分别用DMSO溶解，使用前按照比例配制成相应浓度，环丙沙星依照1 ∶500比例添加，配制两组浓度的抗生素联合用药方案：A组(Group A)，红霉素、氯霉素、泰乐菌素终浓度分别为20 μm，环丙沙星终浓度为4 μg/mL；B组(Group B)，红霉素、氯霉素、泰乐菌素终浓度分别为40 μm，环丙沙星终浓度为4 μg/mL。Plasmocin作为阳性对照药物，根据说明书按照1 ∶500比例进行稀释使用，形成终浓度50 μg/mL。对照组为含有DMSO的10%胎牛血清高糖培养基。每两天更换新鲜培养基，持续培养12天。

1.2.2 PCR支原体检测 引物上游序列5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’，下游序列5’-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3’[19]。PCR反应体系(25 μL)：mix 10 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板细胞上清5 μL，DEPC水6 μL。反应条件：98 ℃2 min，98 ℃15 s，58 ℃ 15 s，68 ℃ 20 s，30次循环，68 ℃ 5 min，4 ℃保存。取8～10 μL 体积的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验(2%)。

1.2.3 CCK8检测 取对数生长期C3A细胞以0.5×104个/孔数量接种于96孔细胞培养板，抗生素联合用药方案处理培养12 d。吸去培养基，每孔分别加入培养基和CCK8试剂的混合液，37 ℃培养箱孵育1 h，运行酶标仪并立即在450 nm处进行测量分析。

1.2.4 支原体荧光检测 抗生素药物处理后，首先弃掉细胞上清，再加入1 mL的细胞固定液，静置20 min，将固定液换取，加入1 mL的Hoechst 33258工作液(覆盖细胞)，室温静置20～30 min。吸掉工作液后，加入去离子水洗涤3次，直接风干，即可在荧光显微镜观察拍照。

1.2.5 qPCR检测 使用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，反转录后进行荧光定量PCR。引物序列见表1，以GAPDH基因为内参。反应条件为： 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40次循环，溶解曲线。

表1 引物序列表

1.2.6 统计分析 实验数据通过GraphPad Prism 7软件(GraphPad Software Inc)进行数据处理分析，组间分析采用t检验，P<0.05认为具有统计学差异，所有数据以均数±标准差表示。

2 结果

2.1 新的抗生素联合用药方案对细胞形态和活率的影响

通过前期研究分析，选取了四种针对支原体去除的抗生素药物：红霉素、氯霉素、泰乐菌素和环丙沙星，组合成为新的抗生素联合用药方案，同时以Plasmocin作为阳性对照药物。连续12 d加药培养支原体污染的C3A细胞，对照组细胞显示出，胞内颗粒较多，细胞边缘不规则，形态不饱满透亮等特征；B组抗生素联合用药方案处理后，C3A细胞出现胞内颗粒显著减少，形态规整，透亮折光度增强等特征变化。抗生素联合用药组的处理对受到支原体污染的C3A细胞形态学有明显的改善(见图1A)。

CCK8试剂检测A、B组抗生素联合用药组和Plasmocin组细胞活率情况。检测结果显示，两组抗生素联合用药方案细胞活率下降至：(98.97±3.567)%，(98.93±2.029)%，无统计学差异；而Plasmocin组活率下降至(91.48±1.111)%，具有统计学差异(P<0.05)。由此可见，Plasmocin处理会对C3A细胞活率具有一定影响。而抗生素联合用药处理组对C3A细胞活率无明显影响(见图1B)。

注：A为抗生素联合用药处理12 d后C3A细胞形态学的观察(x200)；B为两组抗生素联合用药方案和Plasmocin处理后，细胞活率情况；1)P<0.05图1 用药处理支原体后C3A细胞形态学和活率变化

2.2 抗生素联合用药清除支原体效果评价

连续12 d加药培养后，PCR检测C3A细胞上清支原体，电泳结果显示，红霉素、氯霉素、泰乐菌素和环丙沙星，单独添加到细胞培养中，支原体DNA阳性条带仍然存在，去除效果未达到(见图2A，泳道1～3，5)。但是B组抗生素联合用药方案在12 d时间的处理后，PCR电泳结果显示没有支原体DNA条带，表明细胞上清已无支原体，可达到去除效果(见图2A，泳道4)，Plasmocin用药结果相同(见图2A，泳道6)。

支原体荧光染色结果表明，12 d培养中，对照未处理细胞，其周围可见点状或者串点的支原体荧光染色，支原体污染严重(见图2B，白色箭头所示)；A组抗生素联合用药方案仍具有部分点状支原体荧光染色，表明该浓度不能完全清除粘附在细胞上的支原体；B组抗生素联合用药方案可见细胞核着色，细胞形态清晰规整，背景干净，没有出现其余点状或者串点的支原体荧光；Plasmocin组细胞周围和表面也没有出现点状或者串点状的支原体荧光。荧光结果表明B组抗生素联合用药方案处理后，细胞周围未见支原体残留，可达到去除效果(见图2B)。

2.3 抗生素联合用药清除支原体后，主要功能基因表达情况

使用荧光定量PCR检测用药清除支原体后，C3A细胞中功能标志基因：CK18、ALB、CPS1和CYP1A2表达情况。结果表明，B组抗生素联合用药方案的CK18、ALB、CPS1 和CYP1A2相对表达量均升高(1.399±0.057 32、1.357±0.212、4.836±0.554和2.036±0.204)；Plasmocin组只有CPS1相对表达量升高(1.343±0.138)，但是CK18、ALB和CYP1A2相对表达量下降(0.778±0.386、0.414±0.134和0.810±0.071)。因此，抗生素联合用药方案处理支原体后，对于C3A细胞主要功能基因表达有所提升，而Plasmocin的处理并没有恢复细胞主要功能基因的表达(见图3)。

注：荧光定量PCR检测比较，抗生素联合用药方案B组和Plasmocin分别处理12 d后，C3A细胞功能基因CK18、ALB、CPS1 和CYP1A2 相对表达水平；1)P<0.05

3 讨论

在受污染的细胞系分离出20种支原体，其中95%的污染支原体类别为：发酵支原体(M．fermentans)、口腔支原体(M．orale)、精氨酸支原体(M．arginini)、猪鼻支原体(M．hyorhinis)、人型支原体和莱氏无胆甾原体(A．laidlawii)[20]。支原体感染的细胞系本身就是最重要来源污染物，在实验室受污染的细胞，大多数培养物含有相同的支原体种类，存在交叉污染。最新研究表明，支原体污染对细胞产生副作用主要表现为：生长速率降低，形态变化，染色体畸变，细胞因子表达异常，影响外泌体合成，细胞膜组成的变化以及蛋白和基因的改变等[21-26]。在实验大环境下，多种因素诱发支原体污染，除了基础研究，支原体污染影响生物制品生产也是不容忽视[27]。

近年来较为常用的支原体去除药物试剂包括：Plasmocin、BM-Cyclin和MycoRAZOR，都是含有2种以上抗生素药物类型。将2种药物Plasmocin，BM-Cyclin结合应用，支原体去除作用更为明显。这些应用的原理都是基于不同抗生素用药组合产生协同作用，来发挥更好的去除效果[8,10，15]。在初期研究结果中，我们发现单一抗生素的处理已经不能达到去除C3A细胞支原体效果，因此我们建立一种新的抗生素联合用药方案：红霉素、氯霉素、泰乐菌素和环丙沙星组合。不同于其他商品化药物，新的抗生素联合用药方案组成成分清晰，均为临床常见抗生素药物且作用机理不同。在12 d连续处理后可达到去除支原体的效果，同时C3A细胞表面大量异样颗粒物得到减少，细胞形态清晰规整和培养背景干净，维持良好细胞活率等效果。采用PCR检测C3A细胞上清支原体和荧光染色支原体两种途径，共同评价支原体清除效果，避免检测结果的差异性。

在观察支原体去除结果的同时，细胞的生长和功能表达恢复情况也是评价支原体去除效果的有效证明。如果细胞营养和环境条件有利，支原体可以在细胞培养物初期感染快速生长至高滴度[28]。支原体快速生长对于细胞本体的营养物质获取和生物合成也会造成竞争性作用，进而改变细胞蛋白和基因的表达等。正是由于支原体与细胞竞争性共生的模式，新的抗生素联合用药方案处理后，针对C3A细胞主要功能基因CK18、ALB、CPS1 和CYP1A2检测发现，这4种代表性功能基因相对表达均有快速提升，这可能是支原体的去除后，细胞的竞争性生长得到迅速改善，功能基因的表达得到一定程度恢复；而Plasmocin的处理并不能使得C3A细胞功能基因表达得到恢复，反而部分基因表达相对下降。此外，抗生素能够影响肝细胞基因表达和调节，特别是药物代谢和蛋白合成等基因调控通路[29]。这也提示着，抗生素药物的适应性应用不能忽略其对细胞的基因表达调控的影响。

抗生素药物不仅参与调控细胞基因表达，对细胞的生长和形态等也具有影响作用。新的抗生素联合用药方案处理后，C3A细胞出现胞内颗粒显著减少，形态规整，形态透亮折光度增强等形态学特征变化。抗生素联合用药处理对受到支原体污染的C3A细胞形态学有明显的改善。虽然支原体生物学的特定特征定义了它们对抗生素的敏感性和有效性，但是频繁使用抗生素可能引起的抗性或者细胞毒性，进而导致清除不彻底性，可能会掩盖对低度支原体感染的检测[19]。因此，我们检测两种抗生素联合用药方案浓度对细胞活率情况，发现细胞活率下降不明显且没有统计学差异性。这些结果提示着抗生素联合用药方案在合适浓度范围内不仅能改善支原体污染的C3A细胞形态学特征，而且对细胞的毒性影响较小。

在应用范围上，对于临床治疗的细胞，支原体检测结果是放行标准之一[30]。因此支原体的救治处理更应选择成分清晰，具有临床应用背景等特点的抗生素药物。本研究建立的抗生素联合用药方案，均为临床常见抗生素药物组成，对肺炎支原体的抗菌性具良好疗效[31]。因此，新的抗生素联合用药方案可为临床治疗类细胞在去除支原体方面提供应用参考。

本研究目的在于通过使用多种抗生素药物联合用药，降低细胞的抗药性和毒性产生，达到成功治疗或根除支原体污染。虽然清除支原体的抗生素药物是一种方便快捷的救治细胞方法，但从源头上防止支原体仍然是最理想的措施。实验的无菌操作、环境消毒和试剂耗材来源的规范性等，定期检测培养细胞支原体的污染情况也非常关键；此外，建立系统的防治污染策略，才能使支原体污染的可能性降至最低[32-35]。另一方面，并非每种抗生素药物处理都能完全清除处理支原体，常见药物Plasmocin和 BM-Cyclin仍具有10%和 7%的耐药性[36]。因此抗生素作为体外培养预防性和治疗性使用上，仍不可忽视耐药性的监测。