万应理伤膏对小鼠醋酸扭体及二甲苯致炎模型的影响

陈颖博 潘 杰 林静吟 冯小映

万应理伤膏由我院“广东省名中医”黄敏院长的多年临床经验方研制而成，主要由川乌、草乌、半夏等成分组成，具有活血祛瘀、舒筋活络、消肿止痛的功效，对各种跌打扭伤、闭合性骨折[1]及各种外伤引起的疼痛[2]有确切的疗效，治疗有效率达91.80%[3]。临床应用逾二十年，广泛用于中医骨伤的各种治疗，如骨折手法复位等，在华南地区享有盛誉[4]。

万应理伤膏为我院内部的协定外用药，根据我国药品管理的规定[5-6]，仅限于医疗机构内使用。尽管多年来的临床观察[1-3]提示万应理伤膏治疗效果良好且不良反应少，但因缺乏系统的药学临床科学研究，极大地限制了其推广与使用。近年来，随着我院业务量发展及知名度提升，万应理伤膏的年产量和使用量不断攀升。为确保药物的稳定性和安全性，我院已逐步开展万应理伤膏的质量控制体系研究，保证各批次的质量和安全性达标。然而在药效学评价方面，却未曾进行动物模型方面的探索。本研究是国内首次利用小鼠建模对万应理伤膏进行药效学方面考察，为评价其镇痛及抗炎作用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明系小鼠，SPF级，体质量(20±2)g，由广东省医学实验动物中心提供。

1.2 实验药物

万应理伤膏(广州市正骨医院，生产批号 20200501)；基质(卡波姆)；扶他林乳胶膏(北京诺华制药有限公司，生产批号 VP2526202302)；玛贝拉脱毛膏(广州诗妃化妆品有限公司，生产批号 20200521)。

1.3 主要实验仪器

8 mm 打孔器，万分位电子分析天平(SHIMADZU，型号 AUW120D)。

1.4 实验方法[7]

1.4.1 对小鼠扭体法镇痛实验的影响

昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。每天涂药1次(给药前1天用脱毛膏脱毛)，基质对照组涂等量的基质，连续5 d。末次给药后1 h，每只小鼠腹腔注射0.7%冰醋酸溶液0.2 mL致痛。观察并记录小鼠出现扭体反应的潜伏期及15 min 内扭体反应的次数，并计算抑制率和镇痛率。抑制率=[(给药组潜伏期均值-模型组潜伏期均值)/模型组潜伏期均值]×100%。镇痛率=[(模型组扭体次数均值-给药组扭体次数均值)/模型组扭体次数均值]×100%。

1.4.2 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。每只小鼠右耳廓正反两面涂以基质或药物，每天1次，连续5 d。末次给药后1 h，精密吸取二甲苯均匀涂于各鼠右耳正反两面，剂量为每只0.05 mL，左耳不涂作为对照。二甲苯涂耳1 h后，处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，采用8 mm 直径打孔器分别于左右耳对称部位打下耳片，用精密电子分析天平称量各鼠耳片质量，并计算肿胀度和抑制率。肿胀度=左耳片重-右耳片重，抑制率=[(模型组肿胀度均值-给药组肿胀度均值)/模型组肿胀度均值]×100%。

1.5 统计学处理

2 实验结果

2.1 扭体法镇痛实验的影响

2.1.1 对潜伏期的影响

万应理伤膏各剂量组均能明显延长冰醋酸所致小鼠首次扭体反应的发生时间，与基质对照组相比存在非常显著的差异(P<0.01)。其中，高剂量组的潜伏期最长，但万应理伤膏各剂量组的组间差异不具有统计学意义(P>0.05)。此外，高剂量组对小鼠首次扭体反应出现的抑制率为53.28%，高于阳性对照扶他林乳膏组8.02%。万应理伤膏各剂量组潜伏期与扶他林乳膏组相比，组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结果见图1、表1。

表1 万应理伤膏对冰醋酸所致小鼠扭体反应潜伏期的影响

图1 万应理伤膏对冰醋酸所致小鼠扭体反应潜伏期的影响

2.1.2 15 min内扭体的次数

万应理伤膏各剂量组均能有效降低小鼠扭体反应次数，与基质对照组相比存在非常显著的差异(P<0.01)。其中，高剂量组与低剂量组相比，结果存在显著差异(P<0.05)，有统计学意义。就万应理伤膏而言，低、中剂量组对冰醋酸所致的小鼠扭体反应次数有抑制趋势，而高剂量组则能明显减少扭体反应的次数。此外，高剂量组镇痛率较阳性对照扶他林乳膏组高7.79%。但各剂量组扭体次数与扶他林乳膏组相比，组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结果见图2、表2。

表2 万应理伤膏对冰醋酸所致小鼠15 min内扭体次数的影响

图2 万应理伤膏对冰醋酸所致小鼠15 min内扭体次数的影响

2.2 二甲苯致耳肿胀的影响

小鼠二甲苯致炎后，耳廓出现肿胀，万应理伤膏各剂量组均呈现对炎症的良好抑制作用，与基质对照组相比存在非常显著的统计学差异(P<0.01)。其中，抗炎作用最明显的是高剂量组，肿胀抑制率为47.06%，但各剂量组的组间差异不具有统计学意义(P>0.05)。此外，高剂量组抑制率与阳性对照扶他林乳膏组相比，略高1.18%，但组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结果见图3、表3。

表3 万应理伤膏对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

图3 万应理伤膏对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

3 讨论

急性软组织损伤早期引起的红、肿、热、痛等临床症状，是由急性外伤或直接暴力作用于机体而引起的无菌性炎症。临床上主要采用非甾体抗炎药、人工合成镇痛药、糖皮质激素等药物治疗。但这些药物副作用较大，长期使用会对人体多个系统造成影响。万应理伤膏为我院中药制剂，多年来用于治疗急性软组织损伤临床疗效佳，不良反应少，深受医生和患者认可。本研究选用扶他林乳膏作阳性对照药物，因其在国内外上市多年，临床数据充分[8-12]，疗效明确。而万应理伤膏的售价仅为扶他林乳膏的二分之一，是临床用药的有益补充。

扭体法以冰醋酸作为化学刺激评价药物的镇痛效果至今已沿用多年[13-17]，常用作评估药物的外周镇痛活性[18-19]。因其具备操作简便，不需特殊设备、复制成功率高等优点，被广泛应用于国内外研究实验[19-25]，方法成熟可靠[16, 26]。本研究采用扭体法观察万应理伤膏对小鼠的镇痛作用，以小鼠出现扭体反应潜伏期和15 min内扭体反应的次数作为评价镇痛效果的指标。从实验结果看，观察扭体次数比潜伏期更为敏感，能体现万应理伤膏不同剂量的组间镇痛效果差异。低剂量组呈现一定的镇痛作用，随着万应理伤膏剂量增加，镇痛效果逐步增强，呈剂量依赖性，作用最强的是高剂量组。此外，两指标间存在相关性。潜伏期(即首次出现扭体反应的时间)越长，小鼠在15 min内出现扭体的次数越少，两者结合评价更能体现万应理伤膏的镇痛作用。

本研究设定的实验组剂量和疗程均在安全范围内，结果显示高剂量组的镇痛效果最优，提示万应理伤膏的临床治疗剂量可设定为一日5次，以提高严重肿痛患者的疗效。周敏杰在质量标准研究中提到，万应理伤膏以生川乌和生草乌作为君药，加入天然冰片、薄荷脑等引药[27]，产生协同镇痛的作用。笔者认为，鉴于生川乌、生草乌的毒性较大，除了需在制剂生产过程中对其含量严格控制外，临床治疗剂量和疗程的制定也同样重要。使用剂量过大或疗程太长，可能会累积产生毒副作用。今后应深入开展万应理伤膏的毒理学研究，以更好地指导合理用药，避免不良反应，提高临床药物治疗水平。

在小鼠急性炎症模型实验中，采用二甲苯致小鼠耳肿胀来初步考察万应理伤膏的抗炎作用。谷捷等[28]提出在中药创新药研究中，应用二甲苯致炎模型与临床常见急性炎症相似，广泛用于中药抗炎创新药物的抗炎效应评价，也常被药理学等课程实验教学所选用。本研究结果显示万应理伤膏抗炎作用明显，中、高剂量的作用强度相似或高于扶他林乳膏。由此表明，在急性创伤所致的皮肤组织炎症中，使用中、高剂量治疗(一日3～5次)将获得良好的抗炎效果。

尽管本研究取得了一些有价值的结果，但仍存在局限性。本次研究中，尚未开展小鼠热板刺激实验[29]，未测定万应理伤膏对热刺激产生组织损伤所致疼痛的抑制作用。热板刺激实验常用于评估药物的中枢镇痛作用[18]，与评估外周镇痛作用的扭体法结合，可以很好地评价万应理伤膏治疗疼痛的效果。它的缺乏，将影响万应理伤膏的整体疼痛评价。此外，O V Sintsova等[30]在最新的研究中指出，TPRV1受体阻断剂在热板刺激实验中展现较长的镇痛作用。TPRV1是近年研究的热点，被认为治疗疼痛和皮肤炎症[31]的有效靶点。热板刺激实验的推进，有利于明确万应理伤膏发挥镇痛作用的部位和机制。因此，我院将继续开展镇痛效应的研究，逐步充实万应理伤膏的药学临床科学研究基础。

综上所述，在小鼠建模中万应理伤膏初步展现良好的抗急性炎症作用和镇痛作用，药效学研究结果与临床疗效相符。今后仍需进一步探讨物理刺激(热刺激)引起疼痛的抑制效果，并推进药物安全性研究，建立药效学、毒理学、临床药理学等方面的评价。同时，开展临床研究，观察药物不良反应，以明确各种适应症的治疗剂量范围。