肺纤维化相关脂类和氨基酸类代谢物研究进展

马瑞敏，叶 俏

（首都医科大学附属北京朝阳医院职业病与中毒医学科，间质性肺疾病临床诊疗与研究中心，北京呼吸疾病研究所，北京 100020）

肺纤维化是多种不同原因所致间质性肺疾病共同的终末期病理改变，导致肺结构破坏、肺功能障碍甚至死亡。肺纤维化形成过程中涉及多种因子和介质，通过复杂的信号通路介导纤维化的发生。代谢组学是一项应用分离和检测方法捕获表征代谢途径的小分子代谢物的技术。利用代谢组学技术，通过全面分析生物体系代谢产生的小分子代谢物，可获得生化途径相关的信息，揭示肺纤维化形成过程中代谢通路的变化[1]。代谢物是机体新陈代谢的副产品，目前发现至少有3000种初级代谢物对人体生长和发育至关重要。另外，还有数千种未知的次级代谢物，它们对生长和发育虽然不是必需的，但可显示疾病状态，从而有助于更深入地了解疾病的机制，亦可作为疾病诊断、评估和风险预测的生物标志物[2]。肺纤维化相关代谢物包括脂类代谢物〔如溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）和相关磷脂〕和氨基酸类代谢物〔如犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）、L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）、微囊藻毒素、趋化因子和芥子酸（sinapinic acid，SA）〕。本文对其研究进展进行综述，并通过代谢组学分析，以加深对肺纤维化作用机制的了解。

1 脂类代谢物

脂质是细胞膜的基本成分，在细胞的能量储存、信号转导、膜双层结构的形成和细胞屏障等功能中发挥着重要作用。近年来，脂质在呼吸系统疾病中的作用已被广泛研究，包括囊性纤维化、哮喘和慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）等。但脂质代谢谱在肺纤维化中的作用尚未完全阐明。

1.1 自毒素和溶血磷脂酸

自毒素（autotaxin，ATX）是一种分泌型糖蛋白，于1992年从A2058黑色素瘤细胞上清液中分离而来[3]。ATX由脂肪组织、支气管上皮细胞和高内皮细胞微静脉以及大脑中的脉络丛上皮细胞、活化的星形胶质细胞和少突胶质细胞等分泌，而且在外泌体内也可被检测到[4]。ATX在血清、血浆、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、水疱液、脑脊液、腹腔积液和尿液中均具有催化活性[5]。病理研究发现，特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）患者肺组织中的肺泡上皮细胞、间质巨噬细胞、成纤维细胞以及细支气管化生区域均有较强的ATX表达[6]。

LPA也称为酰基-羟基甘油-3-磷酸酯，由酯化成单一脂肪酸的甘油磷酸酯骨架组成，是迄今发现的一种相对分子质量最小、结构最简单的磷脂。LPA通过特定的G蛋白偶联受体传递信号，导致肺内细胞产生不同的反应，包括上皮细胞产生促炎信号、调节内皮细胞生理反应、激活转化生长因子（transforming growth factor，TGF）信号和刺激成纤维细胞聚集。在大多数生物液中也可以检测到LPA，其表达部位与ATX一致[7]。

LPA通过与6个相应的受体结合发挥作用。在肺组织中，LPA通过与LPA受体1（LPA receptor 1，LPAR1）结合后，调节上皮细胞和内皮细胞的屏障功能，诱导成纤维细胞迁移、增殖并分化为肌成纤维细胞，促进肺泡上皮细胞凋亡。在博来霉素诱导的肺纤维化模型中，LPAR1基因缺失可减轻上皮细胞凋亡、血管渗漏和成纤维细胞堆积[8]。LPAR2作用于肺泡上皮细胞，通过调节αVβ6整合素活性，促进TGF-β1产生，参与肺纤维化的形成[9]。磷脂酰胆碱在血循环中含量较高，在磷脂酶A1和A2以及卵磷脂胆固醇酰基转移酶的作用下，水解为溶血性磷脂酰胆碱[10]。体内LPA主要通过ATX途径产生。ATX途径发生在细胞外，通过水解溶血性磷脂酰胆碱产生LPA。非ATX途径发生在细胞内或者细胞膜，细胞质中的磷脂酶A1或A2水解细胞膜上的磷脂酸生成 LPA，并释放到细胞外[5，11]。了解上述相应的转化途径有助于了解其潜在的作用机制。

ATX和LPA在多种疾病中均发挥重要作用，如动脉粥样硬化、肝纤维化、肾纤维化、皮肤纤维化和肺纤维化等[4]。近年来研究发现，ATX抑制剂或LPA拮抗剂可抑制肺纤维化的发展。ATX抑制剂32是一类新型的含有异羟肟酸锌结合功能的化合物。用博来霉素诱导的小鼠肺部炎症和纤维化模型评价其有效性，结果显示，BALF中中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和总蛋白水平以及肺胶原沉积较对照组均降低[12]。在肺纤维化小鼠中使用一种纳米级的ATX抑制剂（GWJ-A-23），模型小鼠肺组织可溶性胶原浓度及BALF中细胞总数和总蛋白、可溶性胶原、TGF-β1和LPA浓度均较对照组显著降低[6]。上述研究提示，ATX抑制剂可能具有抑制肺部炎症和肺纤维化的作用。细支气管上皮细胞和巨噬细胞中条件性ATX基因敲除时，也同样能够缓解肺纤维化[6]。另一种纳米铅化合物ATX抑制剂BI-2545可使啮齿类动物体内LPA浓度显著降低，并显示出良好的安全性[13]。上述结果提示，ATX抑制剂可影响下游LPA的产生。

在动物实验的基础上，关于ATX抑制剂的临床试验取得了一定的进展。一项ATX抑制剂GLPG1690治疗IPF患者的Ⅱa期随机安慰剂对照试验（FLORA研究）于2016年3月至2017年5月进行[14]。该研究发现，GLPG1690治疗的IPF患者外周血中LPA浓度持续下降，且第12周时用力肺活量的下降趋势也较对照组减缓，提示ATX抑制剂对IPF肺功能的下降可能具有延缓作用。一项关于GLPG1690的Ⅲ期随机对照试验（ISABELA研究）也于2018年11月开展[15]，结果有待发布。期待能够开展更多有关ATX和LPA相关代谢通路的临床试验。

LPAR1抑制剂同样可以延缓肺纤维化的进程。在博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠中发现，当LPAR1缺陷时或使用LPAR1拮抗剂Ki16425时，成纤维细胞聚集和血管渗漏明显减少[8]。另一项体外研究也发现，LPAR1有效拮抗剂AM966可减少肺损伤、血管渗漏、炎症和纤维化的发生，还能降低BALF中炎症和纤维化相关生物标志物的表达，包括乳酸脱氢酶、金属蛋白酶组织抑制剂1、TGF-β1、透明质酸和基质金属蛋白酶7[16]。LPAR1拮抗剂BMS-986020治疗IPF的随机双盲安慰剂对照的Ⅱ期临床试验发现，IPF患者用力肺活量下降速度较安慰剂对照组明显减缓[17]。

1.2 其他相关磷脂

肺泡表面活性物质由磷脂组成，肺泡表面活性物质不足与肺纤维化密切相关。二氧化硅诱导的肺纤维化模型大鼠中，BALF中磷脂浓度较正常对照组显著升高，且与肺炎症评分呈正相关，其机制可能是与二氧化硅作用下肺组织分泌磷脂异常和代谢紊乱有关[18]。二氧化硅所致肺纤维化模型大鼠BALF中磷脂含量显著增加，其中磷脂酰甘油百分比降低，磷脂酰肌醇增加，饱和磷脂酰胆碱百分含量无明显变化；在分离的Ⅱ型肺泡上皮细胞中总磷脂增加，细胞内磷脂组成与BALF相似，磷脂酰肌醇相对增加，磷脂酰甘油减少，而且磷脂合成酶胆碱磷酸胞苷转移酶、卵磷脂酰基转移酶和磷脂酰甘油磷酸合成酶的活性也较正常对照组增加[19]。IPF患者BALF中磷脂谱有类似变化，磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油含量降低，磷脂酰肌醇和鞘磷脂的比例增加[20]。Yan等[21]对IPF患者血浆中62种确定的脂类进行层层筛选，发现6种脂质对IPF的诊断具有较高的灵敏度和特异度。IPF患者血浆中甘油磷脂和鞘磷脂含量降低，其他甘油脂、甾体脂和脂肪酸水平有一定程度增加。上述研究表明，肺纤维化患者体内存在磷脂的改变，但是究竟何种磷脂可作为肺纤维化诊断、病情评估和预后的生物标志物尚需进一步研究。

2 氨基酸类代谢物

氨基酸是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物，是构成机体所需蛋白质的基本物质。氨基酸反映机体代谢和功能状态，是体内一类重要物质。

2.1 犬尿氨酸

色氨酸（tryptophan，Trp）是一种必需的氨基酸，Trp＞95%通过Kyn途径代谢，产生具有神经活性的中间体，最终产生NAD辅酶，作用于多种代谢通路[22]。Trp转化为Kyn的限速酶是吲哚胺-2，3-双加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）[23]。Kyn参与多种生物学过程，包括免疫调节、肿瘤生长和神经变性等[24]。多种涉及Kyn的疾病将IDO作为了治疗靶点。

Kyn是一种强大的内源性肺血管扩张剂，可增加靶细胞中cAMP和cGMP的水平，在肺内通过一氧化氮（nitric oxide，NO）/cGMP和cAMP途径发挥血管扩张作用。特发性肺动脉高压患者血清Kyn水平高于健康对照组，在人肺动脉平滑肌细胞中，Kyn与NO有协同作用，在慢性低氧和野百合碱诱导的慢性肺动脉高压小鼠模型中显示出扩张肺血管的作用[24]。

Trp/Kyn代谢途径在肺纤维化形成中起作用。间质性肺疾病患者BALF巨噬细胞中IDO活性明显高于健康人，且存在IDO信使RNA，而健康人BALF中不存在[25]。炎症相关性肺部疾病患者血清Trp水平降低，Kyn浓度升高，Trp/Kyn比值在IPF、结缔组织病相关间质性肺炎和结节病患者中均显著低于健康人[25]。血清Trp和Kyn水平可能提示疾病的活动度。系统性硬化（systemic sclerosis，SSc）是一种极易并发肺纤维化的自身免疫性疾病。SSc患者血清Trp水平显著低于健康对照组；与局限性皮肤型相比，弥漫性皮肤型SSc患者血清Trp水平更低；同时，SSc患者血清Kyn水平高于健康对照组[26]。Trp代谢途径可能与SSc相关肺纤维化的发病有关。

2.2 L-精氨酸

L-Arg是一种非必需氨基酸，是各种蛋白质的基本组分。L-Arg在精氨酸酶作用下产生L-鸟氨酸，进一步代谢成多胺和L-脯氨酸，多胺和L-脯氨酸分别是细胞增殖和胶原合成的基本调节剂[27]。目前至少有2种由不同基因编码的精氨酸酶。其中精氨酸酶Ⅰ是一种在肝组织中高度表达的胞浆酶，在尿素循环中起着关键作用；精氨酸酶Ⅱ是一种线粒体酶，在肝外组织，如肾和肺组织表达。L-Arg也可以被NO合酶代谢成L-瓜氨酸和NO。NO是一种抗纤维化因子，对胶原合成具有抑制作用。

精氨酸酶Ⅰ和精氨酸酶Ⅱ上调使得博来霉素诱导的小鼠胶原过度沉积，促使了肺纤维化的形成[28]。研究发现，精氨酸酶Ⅰ和精氨酸酶Ⅱ在小鼠的肺纤维化病变区表达，且在肺成纤维细胞、肺内巨噬细胞和内皮细胞中表达水平较高[30]。精氨酸酶Ⅰ是影响成纤维细胞胶原合成的关键酶，用精氨酸酶抑制剂NG-羟基-L-Arg处理成纤维细胞，可以减少TGF-β1刺激的胶原沉积，但不能减少胶原mRNA的表达或Smad信号分子水平[29]。TGF-β1是一种促纤维化介质，可诱导精氨酸酶活性，使肺组织成纤维细胞中精氨酸酶活性呈浓度依赖性增加[31]。吡非尼酮处理的同种异体肺移植物中精氨酸酶活性降低，其机制可能是由于吡非尼酮对内源性TGF-β1的抑制作用，一定程度上阻止了移植相关肺纤维化的发生[31]。

精氨酸酶和NO合酶竞争共同的底物L-Arg，精氨酸酶可调节NO合酶的活性[32]。精氨酸酶表达上调导致NO信号失调，间接导致高血压、动脉粥样硬化或哮喘。NO水平降低可导致气道和血管平滑肌细胞增殖，增加肺部感染和肺纤维化发生率，精氨酸酶抑制剂可逆转该情况[29]。联合应用L-Arg和L-去甲缬氨酸可逆转博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠体重下降，降低羟脯氨酸含量，减轻肺纤维化，这可能与其纠正免疫失衡和Arg代谢紊乱有关[33]，联合应用L-Arg和L-去甲缬氨酸有可能成为抗肺纤维化的治疗方法，其可能的作用机制包括L-Arg诱导谷胱甘肽升高，增强抗氧化能力，抑制巨噬细胞释放促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6，抑制NF-κB调节基质金属蛋白酶2和9的活性[34]。

2.3 微囊藻毒素

蓝藻产生的微囊藻毒素是一组含有7个肽链氨基酸的环状化合物。目前已鉴定出80多种不同结构的微囊藻毒素类似物。微囊藻毒素-亮氨酸精氨酸（LR）分别在第2位和第4位显示L-亮氨酸和L-Arg，是微囊藻毒素突变体中含量最丰富的毒物。微囊藻毒素-LR可能对水生动物和人类构成威胁[35]。

长期口服微囊藻毒素-LR可减少TGF-β1/Smad信号分子在大鼠肺组织中的表达，减轻博来霉素诱导的大鼠和异硫氰酸荧光素诱导的小鼠肺纤维化[36]。研究发现，微囊藻毒素-LR介导CD206+巨噬细胞分化减弱和TGF-β1表达减少，这可能和微囊藻毒素-LR与内质网应激的主要调节因子葡萄糖调节蛋白78之间存在相互作用，阻断了应激细胞中内质网未折叠蛋白反应信号的转导，进而抑制上皮-间充质转化和成纤维细胞-肌成纤维细胞转化，改善肺纤维化[36]。该结果为肺纤维化治疗提供了新靶点，关于微囊藻毒素-LR的研究有待进一步开展。

2.4 趋化因子

中性粒细胞是先天性免疫系统的重要组成部分，能够吞噬入侵的病原体，释放抗菌酶，抑制外来病原体所致的氧化爆发[37]。但在清除炎症刺激的过程中，这种有效的抗菌成分也会导致宿主组织的破坏。在COPD、囊性肺纤维化和闭塞性毛细支气管炎综合征中，中性粒细胞导致非靶点细胞外基质破坏和终末器官损害[38]。一项关于SSc的研究发现，弥漫皮肤型SSc患者血清中性粒细胞弹性蛋白酶水平较健康对照组明显升高，且这些患者更易并发肺纤维化[39]。中性粒细胞持续增多可使蛋白水解酶和活性氧进一步增加，进而导致肺细胞外基质的重构[38]。

这种炎性内流由经典的趋化因子（如IL-8）及其下游介质，如胶原片段和中性粒细胞趋化因子肽脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸（proline-glycine-proline，PGP）启动和传播。PGP可以诱导中性粒细胞在肺部病灶中长期浸润，形成中性粒细胞性气道慢性炎症，破坏肺组织，降低肺功能，加快COPD的进展。趋化因子是一组结构相似、相对分子质量为8～12的细胞因子。CXC趋化因子作为趋化因子家族里的一个亚家族，根据是否含有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸（称为ELR基团）可分为ELR+和ELR-2类。目前已发现40多种趋化因子，它们在结构上具有20%～50%的同源性。趋化因子在生理条件下以单体的形式存在，其功能的行使是由趋化因子受体介导而完成的[40]。IL-8是一种ELR+的CXC趋化因子，通过人CXC趋化因子受体1和2募集中性粒细胞[41]。IPF患者BALF中IL-8水平较健康对照组明显升高，且与中性粒细胞数量呈正相关[42]。

脯氨酰内肽酶（prolyl endopeptidase，PE）是胶原合成PGP的终端酶，在慢性炎症性肺部疾病中具有活性。产生PGP所需的所有蛋白酶，包括PE，均在中性粒细胞中发现[43]。PGP通路可独立于经典的ELR+CXCR轴运行，以维持中性粒细胞在炎症反应中的作用。经典ELR+CXCR通路和PGP稳态的紊乱均与COPD活动有关。因此，针对中性粒细胞参与的慢性炎症性疾病，有效抑制CXCR信号通路的治疗策略可能需要同时抑制ELR+CXCR和PGP 通路[38]。

苄氧羰基-脯氨酸-脯氨酸（benzyloxycarbonylproline-proline，ZPP）与PGP的结构同源性表明，ZPP也可能直接影响经典的ELR+CXC趋化因子信号转导。ZPP是一种特异性、非竞争性PE抑制剂，既能抑制ELR+CXC，又能抑制PGP介导的中性粒细胞的趋化作用[38]。ZPP提供了一种新的调节中性粒细胞的双重机制，对以中性粒细胞炎症为特征的疾病具有一定的价值。

2.5 芥子酸

下呼吸道中活化的炎症细胞数量增加导致活性氧和活性氮的产生，引起肺损伤和肺成纤维细胞增殖。多酚类化合物是广泛存在于植物体内的一类具有多效生物活性的植物成分。这些植物成分具有很强的抗氧化或清除自由基的能力，参与抗氧化防御反应。SA是一种多酚类化合物，具有多种药理和化学保护作用，如抗氧化、抗炎、免疫调节、抗组胺、抗微生物和抗肿瘤作用[44]。

博来霉素致肺纤维化模型大鼠中，SA可恢复抗氧化系统，抑制氧化应激，减少BALF中巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞，抑制肺组织中炎性细胞因子（肿瘤坏死因子α和IL-1β）的释放、细胞外基质沉积（羟脯氨酸和基质金属蛋白酶7）和TGF-β1的释放。SA通过抑制NF-κB进而抑制细胞凋亡，诱导核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1介导的抗氧化作用，显著改善肺出血、肺气肿、肺泡间隔细胞浸润和增厚及纤维增生[44]。核因子E2相关因子2是一种帽状转录因子，在对抗氧化应激诱导的肺部炎症和纤维化中起作用[45]。SA和核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1通路的研究为肺纤维化治疗提供了新靶点。

3 结语

肺纤维化是一种导致肺部结构和功能障碍的病理改变。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后的一门了解体内小分子代谢物的学科，反映体内的一系列代谢途径。人体内的代谢物种类繁多，同时有许多代谢物还未被识别，这些代谢物参与体内各种不同的代谢通路，与疾病的发生发展密切相关。代谢组学技术的运用可为以肺纤维化为主要特征的疾病诊断、疾病严重程度评估、风险预测、治疗靶点的识别及药物研发带来新的思路，并丰富对肺纤维化发病机制的认识，也为后续研究提供更多的理论依据。