微小RNA在子宫内膜蜕膜化中的功能

李洪菀菀，杨洁琼，张丛

子宫内膜蜕膜化广义上是指月经周期中子宫内膜在排卵期后发生的一系列变化，包括子宫腺体的分泌转化、特异性子宫自然杀伤细胞的流入和血管重塑等。子宫内膜基质细胞（endometrial stromal cell，ESC）是子宫内膜中主要的细胞类型。ESC在蜕膜化过程中转化为分泌型的蜕膜基质细胞，是蜕膜化过程中最主要的改变。狭义上的蜕膜化仅指ESC的形态改变和生化重编程[1]。不同于大多数哺乳动物，人类的蜕膜化过程不依赖于胚胎着床，是月经周期中的自发性过程，由排卵后孕酮水平上升和局部环磷酸腺苷生成驱动。孕酮和环磷酸腺苷通路在转录组和蛋白质组水平的调控使蜕膜基质细胞能够调节滋养细胞的侵袭，抵抗炎症和氧化损伤，抑制局部母体免疫反应，为胚胎着床和维持妊娠做好准备[2]。若无胚胎着床，蜕膜化的内膜剥脱导致月经发生和子宫内膜周期性再生[3]。蜕膜化在妊娠和月经周期中具有重要作用，蜕膜化不良与反复种植失败、子宫内膜异位症和子痫前期等多种女性疾病的发生有关，严重损害女性健康。

大量相关研究相继发现，许多分子参与了蜕膜化过程，并在子宫内膜蜕膜化和胚胎着床过程中发挥相当重要的作用。蜕膜特异性分子标志因物种而异，人类的蜕膜标志分子主要包括催乳素（prolactin，PRL）和胰岛素样生长因子结合蛋白1（insulin-like growth factor-binding protein 1，IGFBP1）等。这一系列细胞因子、转录因子和生长因子在子宫内膜蜕膜化的进程中起着至关重要的作用。近期众多研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）能够通过对蜕膜化关键基因的作用调控蜕膜化，一些miRNA表达的改变与蜕膜化受损所致的疾病有关。miRNA在多种体液中存在，可能作为疾病诊断和预后的标志物[4]。现对miRNA在蜕膜化中的作用机制进行综述。

1 miRNA概述

miRNA是一类内源性的长约22个核苷酸的非编码RNA，通过序列特异性结合发挥重要的生物学功能。miRNA最经典的调控方式是转录后调控。miRNA的5′序列被称为“种子区域”，靶向mRNA的互补区域，从而介导mRNA的降解或翻译抑制。因此，绝大多数已知的miRNA对相应的靶基因发挥负向调控作用[5]。早期研究认为mRNA上的靶序列仅位于3′非编码区（3′-untranslated regions，3′-UTR），但近年的研究表明miRNA也能够结合5′-UTR和编码区，体现了其更广泛的调节能力[6]。生物信息学预测大量基因包含miRNA靶点[7]，近年亦有研究报道miRNA参与基因转录水平的调控。研究发现一类核内的miRNA能够通过与增强子区结合，上调邻近靶基因的表达水平[8]。由此可见，miRNA在细胞中的调控作用是精密且复杂的。

2 miRNA合成酶与子宫内膜蜕膜化

miRNA的生物合成受到严格的时间和空间控制，它们的失调与许多人类疾病有关。动物miRNA的合成始于细胞核内，miRNA的编码基因由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录后形成miRNA初始转录本（primiRNA）。此时，RNA结合蛋白DGCR8和一种Ⅲ型核糖核酸酶Drosha组成微处理蛋白复合物，特异性识别pri-miRNA茎环基部并切割双链，释放一个约60～70个核苷酸的茎环结构中间体，即miRNA前体（premiRNA）。核内的pre-miRNA由Exportin-5-Ran-GTP复合物转运出核。在细胞质中被RNA结合蛋白TRBP招募的另一种Ⅲ型核糖核酸酶Dicer切割茎环的底部，使pre-miRNA分解为成熟长度的RNA双链，其中包括成熟miRNA及其反向臂片段[9]。miRNA的生物合成在多个层面受到调控，包括：①miRNA转录水平调控；②Drosha和Dicer分别在细胞核和细胞质中对其进行加工；③通过RNA编辑和RNA甲基化、尿苷化、腺苷酸化对其进行修饰；④AGO蛋白质的装载；⑤RNA衰变。miRNA生物合成也可以通过非常规途径实现，包括那些独立于Drosha或Dicer的途径，也正在陆续被发现。

月经周期中，随着蜕膜化进展，分泌晚期的子宫内膜基质中Dicer蛋白水平升高[10]。Estella等[11]研究表明，用雌二醇+孕酮和环磷酸腺苷+甲羟孕酮两种最常用的方案体外诱导人子宫内膜基质细胞（human endometrial stromal cell，hESC）蜕膜化后，Dicer转录水平上调。敲低Dicer再行诱导蜕膜化，hESC中同源框基因A10（HOXA10）蛋白水平下降且细胞内肌动蛋白分布发生改变，提示蜕膜化受抑制。有研究表明，HOXA10影响ESC对孕酮的响应，HOXA10缺失导致蜕膜化障碍和胚胎植入障碍。另有研究发现，Drosha蛋白在孕5～7 d的小鼠胚胎着床部位周围的蜕膜基质细胞中高表达。小鼠在体人工诱导蜕膜化和小鼠ESC体外诱导蜕膜化均能导致Drosha蛋白表达上调，且随体外诱导蜕膜化程度的加深而逐步升高[12]。这两种关键合成酶在蜕膜化过程中的改变为miRNA参与蜕膜化调控提供了重要依据。

3 参与子宫内膜蜕膜化调控的miRNA

3.1 促进蜕膜化的miRNA

3.1.1 miR-21Hu等[13]发现孕5～8 d小鼠子宫内胚胎种植位点miR-21的表达水平上升，且着床部位miR-21表达水平高于着床位点间部位，其下游靶基因RECK的时间及空间分布与之相反。RECK过表达抑制了ESC中蜕膜化标志分子基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表达。MMP在子宫内膜的蜕膜化、滋养层迁移、侵袭、血管生成和细胞外基质重塑中起着重要的作用。另一项研究则发现miR-21通过调节Krüppel样因子12（Krüppellike factor 12，KLF12）和NR4A1的表达促进体外诱导的hESC蜕膜化[14]。子宫腺肌病患者子宫内膜miR-21表达降低，过表达miR-21可以逆转子宫腺肌病患者离体培养的hESC蜕膜化不足。蜕膜中的miRNA还能以外泌体的形式进入细胞外液，Lv等[15]研究发现miR-21在孕小鼠子宫外泌体中表达增加，且可通过上调胚胎中miR-21的水平来抑制胚胎凋亡，促进胚胎发育，为蜕膜化与妊娠调控提供了新的视角。

3.1.2 miR-181aSu等[16]对孕猪子宫内膜miRNA的微阵列芯片分析发现，miR-181家族中的两个成员miR-181a和miR-181c在胚胎种植期表达升高。随后有研究表明miR-181a在hESC体外诱导蜕膜化后升高，并且过表达miR-181a可促进hESC的体外蜕膜化。KLF转录因子家族成员在胚胎植入过程中的母体子宫内膜发育中发挥作用，其中KLF12是hESC蜕膜化的主要的负调节因素之一。miR-181a直接靶向抑制KLF12，促进蜕膜化进程[17]。另外，miR-181a在子痫前期患者蜕膜间充质干细胞或蜕膜基质细胞中表达改变，可能参与了子痫前期的发生发展[18]。

3.2 抑制蜕膜化的miRNA

3.2.1 miR-135bmiR-135b在反复种植失败患者的子宫内膜中表达升高。Zhao等[19]发现miR-135b通过靶向结合蜕膜化中重要的调节因子HOXA10抑制其表达，这一调控关系与Riyanti等[20]在不孕症患者中的发现一致。而Wang等[21]则提出，miR-135b抑制了转录因子FOXO1的表达，使其无法结合到PRL启动子区以激活PRL的转录。这两种作用最终都导致了hESC体外诱导蜕膜化受损，可能是miR-135b影响子宫内膜容受性的原因。此外，Petracco等[22]还发现子宫内膜异位症患者在位内膜与异位内膜间miR-135b的表达存在差异，推测其可能与子宫内膜异位症的病理过程有关。

3.2.2 miR-145miR-145在大鼠孕早期和在体人工诱导蜕膜化模型中表达下调，体外诱导大鼠ESC蜕膜化过程中过表达miR-145可阻碍蜕膜化过程[23]。研究预测并验证了SMAD3是miR-145的直接靶点，miR-145可 抑 制SMAD1及 下 游p-SMAD1/5/8、WNT4、MMP-9、环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达。而且，利用过表达miR-145的ESC培养基培养脐静脉内皮细胞，可抑制血管内皮细胞的侵袭和迁移，这意味着miR-145可能参与蜕膜对血管生成的调控。另外，Smad1基因敲除的小鼠表现出部分蜕膜受损，其机制可能是由蜕膜相关基因[如骨形成蛋白2（BMP2）、WNT4和COX-2]的失调引起的。血管生成是蜕膜支持滋养层侵袭的先决条件，血管生成不良可能导致种植失败及子痫前期等不良后果。Revel等[24]对反复种植失败患者和正常生育妇女的子宫内膜miRNA谱进行了比较，发现13个miRNA差异表达，其中miR-145在反复种植失败患者的表达量为正常生育妇女的3倍。另外，Bashti等[25]对55例子宫内膜异位症和23例正常女性血浆标本进行分析发现，miR-145在Ⅰ期或Ⅱ期子宫内膜异位症患者中表达升高，提示miR-145或可用于子宫内膜异位症的早期诊断。

3.2.3 miR-181b与同家族成员miR-181a不同，研究发现miR-181b-5p在hESC体外诱导蜕膜化时表达下调[11]。在hESC体外诱导蜕膜化的过程中，miR-181b-5p通过调控金属蛋白酶组织抑制剂3（tissue inhibitor of metalloproteinase-3，TIMP-3）、ANXA2等与细胞迁移相关的蛋白发挥作用[26]。另一项研究则认为，miR-18b1b-5p通过调控骨桥蛋白（osteopontin，OPN）参与VEGFA/血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）通路抑制hESC体外诱导蜕膜化[27]。该研究还比较了在体外受精-胚胎移植治疗过程中种植成功与种植失败患者的子宫内膜OPN水平，发现种植失败组OPN表达较低，说明这一通路可能影响了胚胎种植。

3.2.4 miR-222Qian等[28]对体外诱导蜕膜化与阴性对照的hESC进行miRNA微阵列芯片分析并由荧光定量聚合酶链反应（quantitative PCR）验证，发现包括miR-222在内的10个miRNA在蜕膜化处理组表达降低。同时，蜕膜化处理组中hESC处于S期的细胞比例减少，处于G0/G1期的细胞比例增多。靶向敲除miR-222可上调周期蛋白依赖激酶抑制因子1C（CDKN1C）的表达，从而减少hESC中S期细胞的数量。miR-222表达降低使细胞退出增殖周期而进入分化进程，发生蜕膜化改变。另外，一项队列研究发现韩国女性中miR-222基因多态性与反复种植失败风险相关[29]。

3.2.5 miR-542-3pTochigi等[30]利用miRNA微阵列芯片分析鉴定得出，hESC体外诱导蜕膜化组与阴性对照组有6个差异表达的miRNA，蜕膜化组中miR-542-3p表达水平较阴性对照组下调70%。miR-542-3p直接靶向抑制IGFBP1，从而抑制hESC的形态改变和蜕膜化关键基因PRL、WNT4的表达。该课题组进一步研究发现高迁移率族蛋白N5（high-mobility group N5，HMGN5）是miR-542-3p的上游调控蛋白，这种核蛋白通过与染色质纤维中的核小体核心颗粒特异性结合改变染色体致密程度，HMGN5表达下降导致染色体纤维致密化，抑制miR-542-3p的生成[31]。Qu等[32]研究则认为miR-532-3p通过靶向抑制整合素连接激酶（integrin-linked kinase，ILK）表达，导致转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGFβ）信号通路中的重要分子TGF-β1和SMAD2表达下调，从而影响蜕膜化。在hESC中过表达miR-542-3p可抑制VEGF、COX-2和MMP-9的表达，其培养基上清液具有抑制人脐静脉内皮细胞的血管生成作用，提示miR-542-3p可能参与子宫内膜容受性损伤、子痫前期等病理、生理过程。

3.2.6 其他抑制蜕膜化的miRNAYang等[33]研究发现过表达miR-290-5p可降低N-myc下游调节基因3（N-myc downstream-regulated gene 3，NDRG3）的表达，抑制小鼠ESC体外蜕膜化，这与NDRG3激活RAF-细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路进而促进细胞生长和分化有关。Pei等[34]研究表明，miR-194-3p通过对孕酮受体（progesterone receptor，PGR）的负调控抑制hESC体外诱导的蜕膜化，而轻度子宫内膜异位症患者分泌中期在位子宫内膜中miR-194-3p表达增加，PGR表达减少。Zhou等[35]发现miR-196a抑制hESC蜕膜化，且在轻度子宫内膜异位症在位内膜中表达显著增加。虽然该研究并未找到miR-196a的直接靶基因，但发现miR-196a表达的升高导致磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶（p-MEK）/p-ERK蛋白表达上调和PGR-A、PGR-B蛋白表达下调。Pei等[34]和Zhou等[35]认为miR-194-3p、miR-196a和各自下游通路可影响子宫内膜异位症患者内膜的孕激素抵抗。在小鼠延迟种植受体模型中发现，miR-101a和miR-199a*表达在时间及空间上的分布与COX-2有关，并发挥负向调控作用，miR-101a在蜕膜化过程中的表达与COX-2蛋白水平呈负相关[36]。而COX-2被广泛证实在妊娠早期蜕膜化和着床中起到促进作用[37]。miR-96通过调控细胞凋亡抑制小鼠ESC体外诱导的蜕膜化水平，这与miR-96靶向下调抗凋亡因子B淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）有关[38]。miR-148a-3p在反复种植失败患者内膜中表达升高，且过表达miR-148a-3p或抑制其靶基因HOXC8的表达均能使hESC体外诱导蜕膜化受损[39]。此外，miR-149通过与多腺苷二磷酸核糖聚合酶2[poly（ADP-ribose）polymerase-2，PARP-2]作用抑制hESC的蜕膜化，参与子宫内膜容受性的调控[40]。

4 结语与展望

一些miRNA参与了子宫内膜蜕膜化的双向调控，其具体作用机制包括调控激素受体、细胞增殖与凋亡、细胞自噬和细胞周期等。同时，尚有许多测序筛选的差异miRNA的作用有待进一步研究。子宫内膜蜕膜化是人类子宫内膜周期性变化以及妊娠建立和维持至关重要的环节。对于miRNA的研究有助于完善子宫内膜蜕膜化分子调控的网络，并为蜕膜化受损相关女性生殖系统疾病的诊治提供参考。