口腔挥发性硫化物的产生与针对性防治的研究进展

黄培勍 彭显 徐欣

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科 成都 610041

口臭又称呼气异味或口腔异味，是继龋齿及牙周炎之后第三大临床常见口腔病症之一，也是困扰人们的敏感性社会问题，给患者的社会交往带来不良影响[1]。根据检测方式的不同，其患病率为6%~50%[2]。临床上通常将口臭分为生理性口臭和病理性口臭2种，其中病理性口臭又分为非口源性口臭和口源性口臭。80%~90%的病理性口臭由口源性因素引起[3]。

口源性口臭的发生与口腔厌氧菌有着密不可分的联系。通常认为，口腔厌氧菌主要通过产生挥发性硫化物（volatile sulfur compounds，VSCs）导致口源性口臭的发生[4]。传统口臭治疗手段包括使用含除臭或抗菌成分的漱口水、刷牙及使用牙线、舌部清洁等。近年来，出现了使用益生菌、植物提取物、蛋白酶等制剂改善口源性口臭症状的治疗方式[5]。本文就口腔中VSCs的来源以及针对VSCs治疗口源性口臭的研究进展作一综述。

1 口腔中VSCs的来源

1.1 影响VSCs产生的因素

舌苔和牙周炎是导致口腔中VSCs产生的主要影响因素[4]。舌背的表面积约为25 cm2，其较大的表面积、众多乳突状结构以及大量食物残渣和脱落上皮能够加速细菌的附着及繁殖，促进生物膜的形成[6]。研究[7]显示，口源性口臭患者的舌苔面积及舌苔厚度均显著大于无口腔异味人群。与健康人群相比，口源性口臭患者舌苔中微生物种类多样性更显著。口源性口臭患者舌苔中消化链球菌属、拟普雷沃菌属、缠结优杆菌属、口腔杆菌属等的相对丰度较高，且与口腔中VSCs的产生密切相关[8]。

牙周炎是一种慢性破坏性感染性疾病，常导致牙齿周围组织破坏，其发生发展与龈下生物膜密切相关[9]。牙周炎患者龈下生物膜主要由革兰阴性厌氧菌组成，可分解代谢含硫底物，产生VSCs[10]。牙周炎导致的深牙周袋为厌氧菌的代谢和繁殖提供了理想的环境，而代谢产生的VSCs通过提高口腔黏膜通透性、抑制成纤维细胞合成胶原、刺激机体产生炎症因子等作用进一步加剧牙周组织炎症，加速牙周袋加深[11]。早期研究[12]显示，随着牙周炎症加重，受试者口腔VSCs浓度随之升高。有研究[13]发现，口源性口臭患者VSCs浓度与牙周袋深度正相关。然而，也有学者认为，牙周袋内生物膜面积较小、袋口相对封闭，产生的VSCs有限，因此与口源性口臭发生的关联性不及舌苔[14]。

1.2 产VSCs相关厌氧菌

口腔中存在着多种细菌，细菌之间及细菌与组织间存在着多种相互联系。通常认为，口腔中革兰阴性厌氧菌——如具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，F. nucleatum）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）、中间普氏菌（Prevotella intermedia，P.intermedia）、齿垢密螺旋体、伴放线放线杆菌、福塞坦氏菌等是主要的口源性口臭致病菌[15-17]，它们能利用食物残屑和脱落上皮中的蛋白质，产生带有腐败性气味的代谢产物，其中包括多种有机胺类（如腐胺、尸胺）和脂肪酸（如丁酸盐、戊酸盐）等，但导致口源性口臭的最主要成分是VSCs[18]。研究[19]认为，在VSCs中，硫化氢（H2S）和甲硫醇（CH3SH）是导致口源性口臭的主要原因，而二甲基硫化物［（CH3）2S］则主要与系统性疾病（如代谢异常）导致的非口源性口臭相关。H2S和CH3SH由细菌代谢含硫氨基酸产生[20]。H2S可由左旋半胱氨酸脱硫酶（L-cysteine desulfhydrase，CD）分解左旋半胱氨酸产生，该酶由cdl基因编码；CH3SH可由L-蛋氨酸-α-迪米诺-γ-巯基甲烷裂解酶分解左旋甲硫氨酸产生，该酶由mgl基因编码[21]。

研究[22-23]发现，除革兰阴性厌氧菌外，革兰阳性厌氧菌也和VSCs的产生相关。口腔中的蛋白质常以糖蛋白形式存在，需要由革兰阳性厌氧菌分解去除其糖基侧链后才能被革兰阴性厌氧菌利用。研究[24]表明，口腔中的链球菌属与VSCs产生存在关联性。研究[25]发现，革兰阳性厌氧菌中的摩尔梭菌（Solobacterium moorei，S.moorei）可通过表达β-半乳糖苷酶分解唾液中糖蛋白的糖基侧链，协助革兰阴性厌氧菌代谢蛋白质，产生VSCs。研究[26]表明，S.moorei在口臭患者唾液中相对丰度高于健康对照组，且在体外能促进F.nucleatum产生H2S，提示革兰阳性厌氧菌或可通过表达糖蛋白相关分解酶协助革兰阴性厌氧菌产生VSCs，从而促进口源性口臭发生。

2 针对VSCs的口源性口臭防治

鉴于VSCs是口源性口臭主要成因，近年来，口源性口臭治疗多着眼于采取相应手段降低口腔VSCs浓度，减轻口臭症状[5]。当前国内外研究主要集中在两个方面，一方面是通过抑制细菌生长代谢及其生物膜形成，减少VSCs的产生；另一方面则针对已产生的VSCs，通过化学反应或细菌代谢将其从口腔中清除。大量体外实验与临床研究表明，两种治疗手段均能有效降低VSCs浓度，并在口源性口臭治疗中取得了良好效果。

2.1 作用于细菌生物膜

口源性口臭与舌背组织及口腔疾病（包括牙周疾病等）密切相关[27]，破坏及抑制这些部位的生物膜有利于口源性口臭的临床防治。

2.1.1 破坏细菌生物膜 口腔中的细菌生物膜是由大量微生物组成的复杂生态系统[28]。其中，牙周生物膜及舌苔生物膜与口源性口臭的发生相关。前期研究[29]显示，慢性牙周炎及口臭患者在进行牙周基础治疗后口腔异味症状有一定程度改善。临床研究[30-31]发现，慢性牙周炎患者在经过口腔卫生指导及非手术性口腔基础治疗1、4 及6 周后，其菌斑指数、探诊深度及VSCs浓度等较治疗前均有明显降低，提示口腔卫生干预及基础治疗或可通过机械性破坏牙周细菌生物膜，从而减轻牙周组织炎症，减少牙周袋深度，降低口腔VSCs 浓度，改善口源性口臭症状。而在牙周组织基本健康的人群中，口源性口臭的产生与舌苔生物膜密切相关[8]。舌苔中含有大量细菌及脱落的口腔黏膜细胞，是口内主要的VSCs 来源[6]。研究[32-33]证实，使用刮舌器等机械手段清除舌苔有一定的减轻口臭症状的疗效。然而，研究[34-36]表明，长期的机械刺激除疗效持续时间短、易导致刮舌时咽反射等刺激性症状以外，还有致癌风险。因此，使用生物酶等制剂非机械性破坏舌苔生物膜，改善口源性口臭症状成为新的研究方向。临床试验发现，服用含猕猴桃碱成分的含片后可减轻受试者的口臭症状[37]。Mugita等[38]发现，使用从猕猴桃中提取的蛋白酶猕猴桃碱处理舌苔取样培养形成的细菌生物膜60 min 后，生物膜量显著减少；临床试验显示，与安慰剂组相比，服用含猕猴桃碱含片的实验组舌苔明显减少，提示猕猴桃碱等生物酶或能通过破坏原有的细菌生物膜，达到在一定时间内维持口腔较低VSCs水平的效果。

2.1.2 抑制细菌生物膜形成 表面预反应玻璃离聚物 （surface pre-reacted glass-ionomer，S-PRG）是牙齿充填材料的成分之一，能够储存和释放氟、锶、硅、硼、钠、铝等多种离子[39]。研究[40]显示，S-PRG具有抑制生物膜形成的能力。Suzuki等[41]发现，浓度大于20%的S-PRG 能够在不影响唾液细菌生长的前提下有效抑制口腔中生物膜的形成。定量VSCs 检测显示，在建立口源性口臭模型后，使用S-PRG漱口的实验组口腔中VSCs浓度降低速度明显快于使用蒸馏水漱口组，且在30 min 内VSCs浓度可回到实验前正常水平，而蒸馏水漱口组则无法回到基线水平。结果提示，S-PRG 等生物膜形成抑制剂或能通过抑制口腔中细菌生物膜的形成，减少VSCs的产生，从而减少口腔异味。

2.2 作用于口源性口臭相关厌氧菌

厌氧菌作为口源性口臭发生的重要影响因素，长期以来，相关抑菌剂在口臭治疗中即受到广泛关注。近年来，新型抑菌制剂，如益生菌、植物提取物、金属离子、乳过氧化物酶（lactoperoxidase，LPO）等也因其良好的抑制口源性口臭致病菌生长及代谢的能力而应用于大量研究中。此外，通过抑制细菌产臭相关酶及相关基因从而减少VSCs产生的疗法也在体外及临床试验中取得良好效果。

2.2.1 抑制厌氧菌的生长和代谢 锌离子是商用漱口水中常用的抗菌成分之一。Kang等[42]发现，氯化锌（ZnCl2）能够显著地抑制口腔中常见的产VSCs细菌如P.gingivalis、F.nucleatum、福塞坦氏菌、齿垢密螺旋体及伴放线放线杆菌的生长，减少VSCs的产生，提示锌离子或可减轻口源性口臭症状。同时，有学者[43]通过临床实验同样发现，使用含锌离子漱口水3 h 后，实验组测得的VSCs浓度明显低于使用不含锌离子漱口水的对照组，提示锌离子或具有一定的口源性口臭治疗功效。

研究[44]表明，氯己定能破坏细菌细胞膜、抑制细菌生长，因此作为厌氧菌抑菌剂长期应用于口源性口臭治疗中。体外研究[45]显示，低质量分数的氯己定溶液（0.03%、0.06%、0.12%）即可显著抑制唾液中产H2S细菌生长。学者们[46]发现，在使用含氯己定溶液漱口12 h后，受试者口中H2S和CH3SH浓度显著降低，提示氯己定或能通过抑制产VSCs相关细菌生长，减轻口源性口臭症状。然而，化学成分抑菌剂存在导致细菌耐药、引发不良反应等不利因素。Jamali等[47]发现，持续使用氯己定溶液漱口1周后，受试者口臭症状有显著缓解，但在此后3个月的随访中，氯己定漱口液抑制口源性口臭症状的效果逐渐减弱。此外，长期使用含氯己定漱口水可能导致味觉异常及牙齿着色[48-49]。

使用天然成分抑制口臭相关厌氧菌，治疗口源性口臭逐渐成为近期研究热点[5]。益生菌具有形成组织表面保护性薄膜、与致病菌竞争营养物质、激发宿主免疫反应、改变上皮通透性等能力，因此对病原菌的生长及致病具有一定的抑制作用[50]。近年来，随着益生菌对人体健康重要性研究的深入，探究益生菌对口源性口臭抑制作用的研究也逐步推进。Lee等[51]发现，嗜热链球菌HY9012、HY2和HY3均能显著抑制P. gingivalis生长及VSCs产生。也有研究[52]显示，唾液链球菌（Streptococcus salivarius，S.salivarius） K12具有抑制P.intermedia生长及产生VSCs的作用。Benic等[53]通过随机双盲实验发现，与对照组相比，服用3个月含S.salivariusM18含片的实验组口腔中H2S和CH3SH浓度显著降低。上述实验提示，益生菌或能减少口腔中VSCs 产生，具有一定的口源性口臭治疗效果。

植物提取物作为一类安全而有效的口腔护理添加剂成分，近年来受到越来越多的关注。桉油精作为天然成分杀菌剂，长期添加于商用漱口水中[54]。Tanabe等[55]通过研究发现，甘草提取物及其两种主要成分——甘草西定及甘草异黄烷A，均能有效抑制P.gingivalis、P.intermedia生长，从而抑制其产生VSCs。Satthanakul等[56]发现，柠檬香草油提取物具有一定的抑制P. gingivalis生长的作用；临床试验显示，与安慰剂组相比，使用含1%柠檬香草油漱口水的实验组口腔中VSCs总浓度显著降低。此外，法国松树皮提取物、石榴提取物等也被发现具有一定的口源性口臭治疗效果[57-58]。

LPO是在牛奶中分离出的一种糖蛋白，临床研究[59]发现，LPO可降低口源性口臭患者口腔内VSCs的浓度。Nakano等[60]研究发现，LPO可显著降低F. nucleatum和P. gingivalis代谢半胱氨酸及甲硫氨酸的能力，而口腔产VSCs细菌正是通过代谢这2种氨基酸产生H2S和CH3SH。临床研究[61]进一步证实，服用含LPO含片的实验组与对照组相比，在服用含片10 min及30 min后，口腔VSCs总浓度及H2S浓度均明显降低。上述结果提示，LPO或可通过抑制口腔产VSCs细菌的代谢，减少VSCs的产生，以达到治疗口源性口臭的效果。

2.2.2 抑制产臭相关基因及蛋白酶 氯化十六烷吡啶（cetylpyridinium chloride，CPC）是一种长期添加于口腔清洁剂中的季铵化合物，其生物安全性及菌斑抑制性已经验证[62]。研究[63]显示，常规使用含CPC 漱口水可减少口腔中VSCs 的产生。Liu 等[64]通过实验发现CPC 可在不影响细菌其他代谢活动的前提下抑制F.nucleatum和P.gingivalis表达cdl 和mgl 基因，减少CD 酶及METase 酶产生，进而显著抑制F.nucleatum产生H2S 及P.gingivalis产生CH3SH。临床试验[65]同样发现，使用含0.075%CPC漱口水21 d后的实验组与对照组相比，VSCs含量显著降低。上述研究提示，CPC 或可通过抑制产VSCs 细菌相应产臭基因的表达，减少VSCs产生，从而达到治疗口源性口臭的效果。

甲硫氨酸γ脱氨酶（methionine gamma lyase deaminase，Mgld）由P.gingivalis等厌氧菌表达产生，可将甲硫氨酸分解生成α-丁酮酸、氨气和CH3SH。Kandalam等[1]发现，Mgld的抑制剂炔丙基氨基酸（propargylglycine，PGLY）在体外能显著抑制Mgld代谢甲硫氨酸，进而抑制VSCs产生，提示含硫氨基酸分解酶的抑制剂或也适用于口源性口臭相关治疗。

2.3 直接作用于VSCs

除在细菌及生物膜水平抑制VSCs产生外，VSCs反应物、可代谢硫化物的细菌等也常作为直接降低VSCs浓度的治疗手段。芸薹属植物黑芥含有大量的芥子油甙（葡糖异硫氰酸盐）成分，经葡糖硫苷酶和肌苷酶水解后可生成异硫氰酸烯丙酯 （allyl isothiocyanate，AITC）[66-68]。AITC 能与H2S和CH3SH反应，生成二硫化物或二硫代氨基甲酸盐（或酯）[69]。Tian等[70]将不同浓度的AITC分别与H2S和CH3SH室温下于密闭容器中混合，发现AITC在低质量浓度（0.1 mg·mL-1）下就能达到良好的降低VSCs浓度的效果，提示或可利用二硫氰酸酯类化合物作为反应物，将VSCs转化为可溶于水的二硫代氨基甲酸盐，抑或是挥发性及刺激性气味更弱的二硫化物，进而达到治疗口源性口臭的目的。

Kim等[71]将次氯酸钠（NaClO）与VSCs混合后发现，NaClO能显著降低VSCs浓度，且降低速度与其浓度呈正相关。NaClO的这种特性或与其溶液在酸性条件下可释放出二氧化氯（ClO2）气体并迅速与VSCs发生反应有关，提示NaClO能够通过产生ClO2与VSCs迅速发生反应，进而降低VSCs浓度，达到减轻口源性口臭症状的效果。临床试验[72]同样发现，在使用含ClO2漱口水3周后，受试者口内VSCs浓度显著下降，提示ClO2或可适用于VSCs导致的口源性口臭治疗。

泛嗜副球菌（Paracoccus pantotrophus，P.pantotrophus）GB17是一类具有偶联异养硝化-好氧反硝化功能的细菌，它具有硫氧化酶（sulfur-oxidizing enzymes，Sox enzymes）的作用，能利用硫化物作为自身能量来源[73]。Ramadhani等[74]将P.pantotrophusGB17在含硫氢化钠（NaHS）的培养基中培养后测定H2S浓度，结果显示，P.pantotrophusGB17能够明显降低NaHS分解产生的H2S浓度，且该作用与细菌浓度具有正相关性。NaHS溶液在添加Sox酶后H2S产量同样显著降低，该作用也具有Sox酶浓度依赖性。此外，P.gingivalis、F.nucleatum及人唾液样本在与Sox酶混合培养后产生的H2S浓度亦显著减少。

上述研究结果提示，Sox酶及相关细菌或能通过直接作用于硫化物，从而降低其浓度，达到治疗口源性口臭的效果。

3 研究展望

口源性口臭的产生与多方面因素密切相关。传统的口臭治疗常着眼于使用芳香类物质掩盖气味、机械性去除舌苔或使用抗厌氧菌类化学药物控制症状等。然而这些治疗方法或是持续时间较短，或是容易导致口腔内菌群失调及产生耐药性等一系列伴随问题。益生菌、植物提取物、蛋白酶以及VSCs反应物等近年来作为新兴口源性口臭治疗制剂正受到越来越多的关注。与此同时，深入研究口腔中VSCs产生的细菌学及分子学机制将有助于完善口源性口臭相关疾病的病因学理论，也将为口源性口臭治疗提供新的思路。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。