早期胚胎中干细胞自组织的研究进展*

陈诗桦 焦 陈# 金艳花 金福植

（延边大学，1 医学院，2 再生医学研究所，3 附属医院西区医院，延吉 133000）

脊椎动物的发育在直系同源基因组的调控下，首先创建身体轴—前后轴（anterior-posterior，AP）、背腹轴（dorsal-ventral，DV）和左右轴（left-right，LR）以及胚层—内胚层、中胚层和外胚层，然后逐渐发育成各种成体形态。这一系列的发育过程都体现了动物本身的自组织潜能。自组织（self-organization）是一个系统在自组织机制的作用下，其组织结构不断自我完善，自动地由无序走向有序，由低级走向高级，从而提高对环境适应力的过程。组成胚胎的各种固定成分可能被诱导自组织成一个完整的胚胎系统。胚胎发育的多级调控增加了其稳定性，但是这种繁冗的过程使得调控网络十分复杂，比如信号传导控制的上皮细胞极化过程。而胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）来源于囊胚植入前的早期胚胎，具有发育全能性。因此，用胚胎干细胞[1]构建体外干细胞模型进行胚胎学研究，可以脱离上述复杂的调控来揭示胚胎发育的动态过程。

1 自组织的基本原理

自组织原理是研究胚胎系统自组织机制的基础，对帮助了解系统的有序建立及其稳定性的维持意义重大。自组织的方式主要包括细胞重排（cell rearrangement）和细胞命运特化（cell fate specialization）。

1.1 细胞重排

在早期胚胎发育过程中，细胞自组织成黏着性的上皮层，不断地生长和重排，而不会失去其完整性，从而产生了各种各样的组织形状。细胞重排导致原有的对称性被破坏，如何打破最初的对称性以引发不同的细胞命运，最经典的理论是图灵的反应扩散模型，即缓慢扩散的激动剂和快速扩散的抑制剂周期性变化。激动剂和抑制剂都可以看成一种形态发生素，它们扩散形成浓度梯度，梯度实际上就破坏了对称性，称为激动剂-抑制剂的形态发生模式。该模型的产生基于形态发生素的相互作用，在反应扩散模型中，如果一个形态发生素在一定程度上诱导自身抑制剂的表达，那么两个相互作用的形态发生素的浓度将因扩散速度不同产生周期性变化。说明细胞重排可能取决于其表达的形态发生素在浓度梯度中的位置。

激动剂和抑制剂对原肠胚形成的调节都可见于小鼠胚胎[2]，基于图灵模型做一推理：激动剂在一定程度上诱导其自身抑制剂的产生，但抑制剂在组织中的扩散比激动剂更快。结果在某一区域，激动剂和抑制剂的峰值表达在同一位置，而不是相反位置，在其他区域，或是激动剂占优势或是抑制剂占优势。因为信号通路通常涉及分泌抑制剂，那么用图灵模型解释的细胞重排可能是通过改变激动剂和抑制剂峰值表达的位置，实现对特定信号通路的调控，从而破坏细胞原有的对称性。

1.2 细胞命运特化

在发育和整个生命过程中，必须生成各种特化细胞以确保每个组织和器官的正常功能，即细胞发生命运特化。影响细胞命运特化的因素有许多，如染色质影响细胞重排，并决定细胞命运[3]；细胞外相互作用控制细胞几何形状[4]。 除此之外，在细胞间传导的趋化细胞因子也决定着细胞命运。

细胞间相互作用对维持特定的调节状态至关重要，组成特定组织的细胞表达相同的转录调节状态，即细胞命运特化所必需的信号（趋化细胞因子）在细胞间持续传导。例如：μcolony模型（μcolony model）中，趋化细胞因子在多能性或骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）作用时促进集落内细胞实现共同命运。1988年Gurdon等[5-6]在植物细胞诱导非洲爪蟾动物帽细胞向肌肉细胞转变的过程中观察到了共同命运现象，称为集团效应（community effect）。

2 胚胎早期的自组织现象

受精等一系列过程逐步引发胚胎细胞进行命运特化，最终形成含有胚胎上胚层、胚外原始内胚层和滋养层等3种细胞类型的囊胚[7-8]。哺乳动物的发育在囊胚植入前相当保守[9]，但从植入到原肠胚形成，胚胎发育的调控机制逐渐复杂化，并涉及很多自组织现象。

2.1 胚胎自组织作用

囊胚植入开启了母体子宫和胚胎之间的信息交流，导致胚胎和母体间发生组织重组。但比较胚胎学指出，母体子宫和胚胎之间的信息交流不是哺乳动物胚胎早期形态发生的必须条件。例如，人类胚胎发生的关键阶段是在没有任何母体组织的情况下进行的[10]；在猪、兔和牛等哺乳动物的胚胎中，胚胎形态发生和原肠胚形成（morphogenesis and gastrulation）都在囊胚植入前进行[11-12]。且不同物种哺乳动物的组织间基本关系虽然相对保守，但从小鼠的圆柱形胚胎到人类的二胚层胚盘胚胎，囊胚植入后皆在母体中呈现出了不同的胚胎结构。以上均说明哺乳动物胚胎具有很强的自组织能力，并且可以肯定的是，囊胚植入前的早期胚胎形态发生主要依赖于胚胎自组织，植入后再由子宫内环境帮助完善[13-14]。

2.2 胚胎与胚外组织的相互作用

胚胎和胚外组织之间的相互作用对胚胎结构的塑造至关重要。在小鼠中，极性滋养外胚层细胞在上胚层分泌的成纤维细胞生长因子4（fibroblast growth factor 4，FGF4）的作用下增殖为胚外外胚层[15]，并将继续发育成胎盘；前脏壁内胚层（anterior visceral endoderm，AVE）分泌的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）可以刺激上胚层和外胚层逐渐形成管腔[13，16]，然后融合成羊膜腔[17]。这是构建小鼠身体结构的基础，也与AVE成为前部信号传导中心时发生的对称性破坏事件相符合—即胚外组织在哺乳动物胚胎中的作用可能不是诱导身体轴的形成，而是诱导早期胚胎的对称性破坏[18-19]。在人类胚胎中，上胚层形成管腔的方式类似小鼠，其中一个重要区别是：与滋养层接触的上胚层形成羊膜上皮，而与下胚层（与AVE等效）接触的上胚层形成上胚层胚盘[1，9，20]。

3 胚胎相关干细胞的自组织研究

在上述自组织原理基础上，体外胚胎干细胞模型被提出并不断完善，更大程度地还原了早期胚胎发育过程，包括微图案化培养的胚胎干细胞自组织模型、3D细胞培养的干细胞自组织模型、类原肠胚（gastruloids）模型等。

3.1 微图案化（micropatterns）培养的胚胎干细胞自组织

基于人类胚盘（embryonic disc）圆盘状的特性和ESCs能够分化为上胚层的特性，可以通过微图案化培养建立胚胎干细胞体外二维模型进行自组织过程的研究。在微图案化培养过程中，需要限制ESCs生长集落的大小和形状[21]，并且添加BMP4以提供形态发生素（morphogen）引发物来模拟胚外滋养层环境。在这个环境中，ESCs首先以几何约束的方式逐渐生长发育为胚外内胚层（extraembryonic endoderm，XEN），模拟的胚外滋养层环境再继续诱导ESCs发育成细胞分布不同的三胚层胚胎[22]。中、内胚层细胞都表达了相同的标志物Nanog、Brachyury，并受Wnt和Activin/Nodal诱导的BMP4下游信号调控。而外胚层在分泌抑制因子的保护下免受形态发生素的影响，相同的分泌抑制因子同时限制原条（primitive streak）空间发生。因此，在最初的ESCs自组织过程中，一层均匀分布的hESCs可以在大约2 000个细胞的范围内自构型（self-pattern）而不受胚外组织的影响。不仅如此，微图案化培养还可以方便探究ESCs自组织过程中影响细胞命运的因素。

细胞距集落边界的距离与细胞命运息息相关。极化上皮细胞中的信号传导过程十分复杂，人胚胎干细胞（human ESCs，hESCs）通过顶面—底侧极性化[23]（apicobasally polarized），使BMP、Activin、Nodal受体位于基底侧，除了集落边缘的细胞，其他位置的ESCs都不能通过顶端的配体接受信号，从而阻碍中心的细胞一系列信号传导过程。而细胞分泌的BMP抑制剂Noggin（头蛋白）又抑制信号向集落边缘传导，当BMP抑制信号开始传导时，信号只能有序地从顶端开始激活。这样，距集落边界不同距离的细胞通过激活或抑制不同路径的信号传导，使中心细胞和边缘细胞的发育走向不同方向[24]。

通过对ESCs顶面—底侧极性化发生的受体分布差异进行空间定位，能够了解为什么羊膜腔（面朝外胚层顶侧）不会短接形成近—远端形态（proximal-distal patterning），以及初始BMP反应只在近端发生却能诱导、调控远端侧原条衍生物生长发育的原因[24-25]。通过这样的ESC体外二维模型能够方便探究影响小鼠原条衍生物发育的几何、化学因素。

3.2 3D细胞培养的干细胞自组织

ESCs和胚外干细胞（extraembryonic stem cells）已被证实在3D细胞培养中可发生自组织[26-30]。ESCs的3D细胞培养方法较微图案化培养更贴近真实胚胎发育情况，还能够控制ESCs之间在生长时的相互作用力和化学因素对自组织的作用。

利用3D细胞培养进行胚胎干细胞自组织研究，需要将hESCs置于3D软凝胶培养基上，并在其中掺杂入低浓度的ECM成分[31-32]，这种处理可以诱导细胞团根据原始细胞密度折叠形成封闭的极化壳，即顶底极性壳（apicalbasal polarized shell），产生鳞状、柱状或不对称的囊。鳞状囊是一种具有鳞状上皮细胞形态，但不表达干性标志物Nanog、Oct4和Sox2，由BMP信号调控[31]的羊膜样组织。而柱状囊将发育成外胚层，不对称囊则经历对称性破坏事件形成植入后羊膜囊胚[32]（post-implantation amniotic sac embryoid，PASE）。这种由hESCs自组织形成的不对称囊胚，类似于人羊膜囊植入后的阶段，其特征是中央羊膜腔被连续的上皮细胞包围，在BMP的作用下，通过Wnt信号调控，极化并破坏对称性[33]，从而形成原始外胚层和后部原条（posterior primitive streak）。

根据这些结构的形成过程，推测由此产生的羊膜囊的形态发生可能依赖于Snai1调控[32]的上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并且需要BMP在假定的上胚层诱导Brachyury 表达，但其中的对称性破坏机制仍然未知。该ESC体外3D模型对人类植入后羊膜囊发育的多个事件进行模拟，从而进一步理解胚胎形态发生的调控和细胞命运特化。由于能够在3D培养凝胶表面定位，未来的研究将可以阐明形态学如何影响细胞间信号传导。

3.3 基于拟胚体（embryoid bodies，EB）的干细胞自组织

EB是由ESCs在体外通过分化而形成的三胚层结构。在体内，细胞的分化依赖于信号转导和形态发生素梯度分布；在体外EB模型中，这一特点体现于原条的形成，主要与Wnt信号通路的局部激活有关[34]。在Wnt信号通路介导的激活域，ESCs经历了EMT，并分化为中胚层祖细胞，在外源性Wnt3a蛋白作用下，继续分化成中胚层。这样的EB体外分化模型为激发干细胞的自组织潜能提供了另一种方法：一组mESCs经Wnt激动剂处理后，会经历对称性破坏，自组织成一个表达身体轴—AP、DV和LR轴[35]的管样组织，被称为类原肠胚，与体内早期胚胎明显相似。

基于EB的ESCs自组织模型，即类原肠胚的形成过程与时间顺序和胚外组织中信号的空间分布[36]紧密联系，由Wnt /β-catenin与Nodal信号转导精确控制，在恰当的时间顺序和嵌套的伸缩域重现了原肠胚形成时胚胎基因表达的“时空”模式，比如39个HOX基因[37]按顺序地激活，以调控胚胎枕后区域的形成。这样的胚胎干细胞体外模型模仿体内早期胚胎真实的基因“时空”表达模式，并且体现身体轴基因调控系统的特征，展示了类原肠胚模型研究哺乳动物早期胚胎发育调控过程的优越性。

3.4 胚外干细胞的自组织

ESC模型揭示了同类细胞群如何通过自组织过程产生不同的细胞命运。然而，这些模型无法最真实地模拟体内胚胎发育，其不足之处在于它们缺乏胚外组织，而胚外组织对胚胎发育至关重要，并为信号传导的相互作用提供了空间环境。不同类型的干细胞之间不仅能相互传递信号，而且每个干细胞都是胚胎空间形态发生的基础，因此，在胚胎干细胞与胚外干细胞相互作用的前提条件下，经过自组织过程很可能会形成类原肠胚结构，诞生了新的干细胞胚胎模型[38-40]。

将mESCs与滋养细胞干细胞（trophoblast stem cells，TSCs）结合在ECM中进行培养[38]，形成了一个形态发生与天然胚胎明显相似的植入后胚胎样结构。在该模型中，细胞在Nodal信号[38]的调控下，开始自组织，发生极化，并在ESCs衍生的胚胎和TSCs衍生的胚外区室中形成管腔，然后相互融合。这样的胚胎模型被称为“ETS胚胎[38]”。ETS胚胎形成过程中，响应Wnt和BMP信号，于ESCs和TSCs的交界处出现中胚层和原始生殖细胞标志物及Brachyury不对称表达域。较之仅使用ESCs来源的结构（如拟胚体），ETS胚胎能更贴近地模拟体内早期胚胎结构的形成和基因表达的“时空”模式。

这样的极化胚胎样结构仍具有局限性，虽然能诱导中胚层形成，但不继续形成原肠胚。用第3种类型的干细胞—胚外内胚层干细胞（extraembryonic endoderm stem cells）代替ECM进行培养后，所形成的结构在形态学、基因表达和信号传导等方面与植入后早期胚胎更为相似。这样的结构在活跃的BMP和Wnt信号调控下自组织形成的脏壁内胚层（visceral endoderm，VE）成为一个信号中心，在腔隙融合的过程中通过促进对Nodal和Wnt信号传导的抑制作用控制AP轴发生和EMT，破坏胚胎和胚外边界，从而形成中胚层和定形内胚层（definitive endoderm）[40]。最后，可以观察到依据胚胎发育时空特征表达出的原始生殖细胞标记物。在这个过程中，ESCs迁移形成的中胚层，夹在外胚层和XEN衍生的AVE之间，而定形内胚层会取代XEN成为早期到中期原肠胚形成的标志，这指出了来自胚胎和2个胚外组织的细胞的正确编排是形成正常胚胎形态的根本条件。这样的胚胎样结构植入小鼠母体后会诱导蜕膜反应（decidua reaction），但不会进一步发育。

干细胞模型具有很大的植入后发育潜能，将mESCs与TSCs在非贴壁条件下共同培养，可产生在形状、基因表达和细胞间通讯方面与囊胚明显相似的植入前胚胎样结构。其形态在更接近真实胚胎的胚外干细胞衍生物环境下能够更加完善。同样，最新发现的新型多能干细胞系EPS细胞，能够形成胚胎和胚外组织，并为基础和转化研究开辟了新的途径[41]。

4 总结与展望

胚胎发生相关的干细胞模型可以通过调控胚胎发育的几何形状、生长环境及改变实验方法来探究胚胎和胚外组织相互作用，以解析经典的胚胎发育过程。例如原肠胚形成是在形态不规则的胚胎样结构中进行的，但目前还存在许多问题尚未解决：模型构建初始是否需要调节该胚胎样结构形态以还原相同体内生长环境；原条发生具体受哪些物理、化学信号调控；在没有AVE的情况下能够在多大程度上诱导原肠胚形成等。

胚胎无法植入是早期妊娠流产的主要原因，但是人类胚胎中此阶段发生的细胞和分子变化仍然未知。为达研究目的，利用人类囊胚和子宫内膜细胞的共培养模拟植入后形态发生的母体环境。然而，这些模型在多大程度上还原了人类胚胎植入后的发展，仍然是一个悬而未决的问题。因此，干细胞自组织模型能更好地阐述由形态和时间控制的遗传决定因素如何调控早期胚胎发育。

构建干细胞自组织模型时，胚胎干细胞团的每个成员都开始特化，并自组织成为胚胎，就像在体外从纯化的组分中重建生化系统一样，体现了从局部中理解整体的重要性。例如，“将hESC与人类TSC以及潜在的人类下胚层干细胞结合，可以重现人类母体妊娠过程”。但是由干细胞衍生而来的胚胎只是研究生物体发育的实验模型，因此它们不能完全重现生物体发育过程中的所有复杂性。这是胚胎干细胞模型的局限性，也是未来研究需要解决的问题之一。干细胞胚胎学领域正处于起步阶段，未来实验研究将通过优化调整相关化学和物理参数以及选用具有更大发育潜能的干细胞系来促进干细胞自组织模型的发展并扩展其应用前景。