二代测序技术在感染性疾病诊断中的应用进展

王素梅，张健东，刘树业 (1.天津市第三中心医院检验科，天津 300170；2.天津市人工细胞重点实验室，天津 300170；3.卫生部人工细胞工程技术研究中心，天津 300170)

目前全球感染性疾病现状严峻，但感染病原体大多仍不明确，病原体的快速测定对临床医师指导临床用药非常重要。然而，目前的诊断方法在许多方面都是有限的，如检测范围、耗时、特异性和灵敏度。传统病原检测方法包括微生物培养、镜检、抗原/抗体的免疫学方法、鉴定、药敏在感染控制中发挥着重要作用。检测病原体特异核酸序列的 PCR方法和基因分型方法等，已经无法满足对病原谱全面检测的需要。

随着基因测序技术的不断发展，二代测序亦被称为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)技术也逐步成长为主流的测序技术，该技术发展迅猛，通量高、速度快、成本低。NGS 不需要靶特异性引物，在单次序列测定中可确定菌株基因组完整的DNA序列,可用于所有病原体的鉴定和分型。因此，该技术可在医学微生物实验室和感染控制中发挥巨大作用[1-2]。

1 NGS简介

NGS即高通量测序技术，在基于序列的基因组研究和新型生物学应用方面逐步推进，有望以前所未有的速度对DNA进行测序。与传统的测序方法相比，这些新的非基于Sanger的技术具有通量高，测序速度快，运行成本低和准确性高等优势。核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成末端的标记来确定DNA的序列。其特点是能一次并行几十万到几百万条DNA分子的序列测定，且一般读长较短。在极大降低了测序成本的同时还极大提高了测序效率，是目前病原微生物研究领域应用最为广泛的测序手段。NGS无需克隆这一繁琐的过程，而是将连接通用接头的基因组DNA 片段进行高通量的并行PCR、测序反应，所获得的大量测序数据经高效能的计算机生物信息分析技术分析即可获得完整的 DNA 序列信息[3]。现有比较成熟的NGS平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system[4]。

1.1Roche/454 FLX：Roche/454 FLX是采用焦磷酸测序原理的测序技术，T、A、C、G，4 种碱基按顺序依次循环进入 PTP(Pico Titer Plate)反应板，当碱基配对同时释放一个焦磷酸。在双磷酸酶，荧光素酶，DNA聚合酶和ATP硫酸化酶的协同作用下，经过相关反应，荧光素被氧化成氧化荧光素，并释放出光信号，每延伸1个或若干个碱基，就会发出一次光信号，GS FLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。454技术最大的优势在于读取长度大，重复序列少，当前454技术的平均读长可达400bp，它最主要的一个缺点通量较低，成本相对较高，无法准确测量同聚物的长度。适用于从头测序和宏基因组测序，序列拼装和获得新基因。

1.2Illumina/Solexa：Illumina/Solexa测序的核心思想是“边合成边测序”(seqencing-by synthesis，SBS)的方法。在碱基延伸过程中形成正确的碱基互补，体系中同时添加改造过的DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP。基因组 DNA 片段绑定到芯片上(即 Flow cell)，这些 DNA片段经过延伸和桥式PCR反应后，将每一个DNA片段扩大百万倍，形成一个序列单一的Cluster。每个 Cluster 是具有数千份相同模板的单分子簇。利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸在碱基延伸过程中对核酸片段进行高通量、快速的检测。Solexa 测序技术最大的优势在于高通量、低错误率、低成本、应用范围广，它最主要的缺点是读长较短给从头测序拼接带来困难，适用于RNA 测序和表观遗传学研究。

1.3ABI SOLID 技术：ABI SOLID测序没有采用常用的DNA聚合酶，而是 ABI 公司使用的基于磁珠的大规模并行连接测序平台，连接反应的底物是荧光标记的8碱基单链DNA探针。其3′端 的1-5 位是随机碱基，且 1、2 位构成的碱基对可以表征探针的荧光类型，6～8位是能够随意配对的人工合成的特殊碱基，5′端为荧光基团。连接反应中，这些探针与单链 DNA 模板链配对，发出不同的荧光信号，从而读取到碱基排列顺序。这样经过 5 轮测序反应后便可以得到所有的碱基序列。SOLID测序具有高通量，高准确度，易区分 SNP和测序错误等优势，原始测序准确性高达99.94%，可以说是目前第二代测序技术中准确性最高的了。它最主要的缺点也是读长较短给从头测序拼接带来困难，使用于高 GC 含量的样品，基因组重测序和SNP 检测。

2 NGS在感染性疾病中的应用

近年来，全球感染性疾病层出不穷，一方面疑难病原菌不断增多，另一方面传染病的传播速度明显加快。直接从临床标本中检测核酸序列为病原菌的监测和发现提供了新的机会。分子技术已成功应用于博尔纳病病毒、丙型肝炎病毒、辛诺柏病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(人类疱疹病毒8型)、巴尔通体、滋养层疱疹病毒、西尼罗河病毒以及与严重急性冠状病毒相关的传染源的鉴定[5-7]。感染性疾病威胁着人类的健康，因此对感染性疾病的快速诊断提出了更高的要求。NGS技术在感染性疾病的快速检测、追踪溯源中发挥了越来越重要的作用。

2.1NGS在神经系统感染性疾病中的应用：中枢神经系统感染是神经科常见疾病之一，常为疑难重症，神经感染性疾病确诊的依据在于从脑实质或脑脊液内检测到病原生物的存在，但受目前临床实验室检测手段的限制，超过一半的脑炎和脑膜炎病例无法明确诊断。目前临床常用的病原体检测方法包括脑脊液细胞学、病原体特殊染色与形态学鉴定、细菌与真菌培养、病原体核酸检测等，主要针对特定种类的病原体进行有选择性的检测，而二代测序技术则旨在通过宏基因组分析，达到无偏倚的“全病原体”筛查[8-10]。Wilson MR等报道[11]了一名14岁的严重联合免疫缺陷男孩在为期4个月的时间内，三次出现发烧和头痛，进而发展为脑积水、癫痫状态和昏迷。包括脑活检在内的检查均未明确其致病病原体。二代脑脊液测序发现3063784序列中有475个与钩端螺旋体感染相对应(0.016%)。给予针对性的青霉素治疗，患者在32天后出院回家。Piantadosi 等报道[12]了一例61岁男子因双侧头痛、步态不稳、嗜睡和精神错乱入院。入院第11天CSF中快速宏基因组测序检测到Powassan病毒。比标准血清学测试早4周。结果显示了宏基因组测序的极高灵敏度，这对于监测新出现和未充分研究的病原体至关重要。2018年，由北京协和医院神经科关鸿志教授牵头的多中心脑炎协作组，对疑似感染性脑炎而病因未明者行脑脊液NGS，结果2例检测出伪狂犬病毒( pseudorabies virus ，PRV )[13]，NGS可以发现以往未知的病毒性脑炎类型。多个高质量的个案报道和临床研究已经表明，NGS 有潜力成为神经感染性疾病的诊断工具，有学者[14]建议将NGS 作为脑炎病原学诊断的常规方法开展。

2.2NGS在呼吸道感染性疾病中的应用：NGS具有独特的潜力，可以克服诊断和检测方面的挑战，并且可以显著提高我们检测和诊断病原体感染的能力。随着NGS方法成本的下降，基因组测序和生物信息学的最新进展使得该技术在常规诊断环境中得以应用，当金标准技术未能检测到推定的病原体时，NGS技术为我们提供了前所未有的机会。近年来，新发突发病原体造成的传染病疫情给公共卫生防控带来了严峻挑战。快速准确识别致病病原对制定疫情防控策略至关重要。在呼吸道感染中，NGS已用于多种呼吸道标本检测，包括痰、咽拭子、肺泡灌洗液等，并表现出良好的诊断性能。Fischer 等收集了24个呼吸道样本(支气管肺泡灌洗液、痰样本和拭子)和来自肺炎患者的5个支气管肺泡灌洗液[15]。与实时定量PCR检测流感病毒序列相比，在24个样本中，有18个样本中检测到了流感病毒序列。从8个样本中可以获得完整的流感病毒基因组。此外，在24个流感阳性样本中的3个样本中，可以检测到额外的病毒病原体，24个样本中的2个样本显示，已知在流感病毒感染期间引起重叠感染的个体细菌物种数量显著增加。因此，NGS对已知或疑似流感患者的呼吸道样本的分析提供了与临床研究相关的有价值信息。Fisher等报道[16]了德国一名警察由于ARDS被送到急诊室，患者接受了机械通气，通常引起肺炎的病原体的所有诊断检测结果均为阴性，虽然立即启动抗菌药物治疗，患者在多器官功能衰竭后6天死亡。当第二名警察因ARDS被送往同一急诊室，医生提取支气管肺泡灌洗(BAL)标本中的RNA，50 h 内测序检测出鹦鹉热衣原体，经过11天的抗菌药物治疗后，患者2的情况有所改善，患者被转移到综合医院病房。因此，快速、特异且高通量的病原体检测方法，对有效诊断和及时防治感染性疾病具有重要的意义。

2.3NGS在器官移植相关感染中的应用：器官移植是器官衰竭终末患者的重要治疗方法，然而用来预防排斥反应的药物抑制免疫系统，导致移植受者常常有较高的感染风险。NGS能够确定感染患者的致病病原。Ye 等报道[17]了一名2 岁男孩，为粒细胞白血病患者在进行造血干细胞移植后，出现黑色皮疹、高热等症状。使用分离培养和 PCR 检测可疑病原均为阴性，一些常规的抗菌药物治疗无效，包括万古霉素、美罗培南、妥布霉素、头孢吡肟和利福平。在这种情况下，儿科医生借助下一代测序技术发现潜在的病原体痤疮丙酸杆菌，从而指导他们对病原菌使用特定的药物，患者迅速好转。Palacios 等报道[18]了三名患者在同一天接受了来自同一个捐赠者的内脏器官移植，在移植后4至6周死于发热性疾病。对各种传染源的培养、聚合酶链反应(PCR)和血清学分析以及寡核苷酸微阵列分析都缺乏信息。高通量测序产生103,632个序列，其中14个符合一种新型沙粒病毒(Arenavirus Burden)。另外的序列分析表明，这种新的沙粒病毒与淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒有关。 基于独特序列的特异性PCR测定证实了病毒在接受者的肾脏，肝脏，血液和脑脊髓液中的存在。 免疫组织化学分析显示接受者的肝脏和肾脏移植物中的沙粒病毒抗原。 在供体血清中检测到IgM和IgG抗病毒抗体。移植后感染病原的早期诊断会降低移植后感染死亡率。

2.4NGS在血流感染性疾病中的应用：早期发现和鉴定血流感染(BSI)中的病原体对于尽快启动或调整抗生素治疗非常重要。目前用于诊断BSI感染的金标准是血培养，但一般需要一至几天，NGS直接检测血液样本中的病原体，保证了更快的诊断速度。在脓毒血症诊断中，NGS显示了独特优势，补充了传统病原学诊断方法的不足，具有很大的临床应用价值。Long等在北京协和医院ICU 开展的单中心研究纳入 78 份脓毒血症患者血样[19]。统计细菌及真菌的检测结果，最终有 8 份标本培养和测序结果一致均为阳性，3 份标本培养结果为阳性而测序为阴性，9 份标本培养结果阴性而测序为阳性。以培养结果为“金标准”，NGS的灵敏度及特异度分别为72.7% 和 89.6% ；采用血培养联合NGS诊断细菌或真菌感染，阳性率较单用血培养显著升高(23.08% 和 12.82%，P=0.013) 。此外，通过二代测序还在 14 份血样中检测到 15 种病毒，且均通过桑格法测序验证。这表明二代测序联合血培养可进一步提高病原学诊断的阳性率。Abril 等报道[20]了一位60岁男性感染性休克和多器官衰竭的病例，该病例是由一种新的全基因组下一代测序分析在24 h内诊断出来的，由血浆全基因组NGS诊断和16S rRNA测序证实为犬Capnocytophaga感染。这项技术在识别疑难病原体方面显示出巨大的前景，它对传染病诊断具有深远的意义。体现出宏基因组技术相对于传统检测方法具有更高的效率。

3 总结与展望

NGS技术作为一种迅猛发展的新技术，突破了传统检测方法的局限性。针对难以培养或者原因不明的病原体感染患者，利用NGS可直接对样本中的病原体 DNA 进行检测，利用已建立的专业病原体数据库，通过自动化数据分析得出准确可靠的病原体遗传信息，推动了临床微生物学和感染病学的发展[21-22]。但是其仍有一些局限性亟待解决：①NGS 工作流程的改善，例如缩短文库构建和验证时间以及数据分析自动化等问题还需要进一步研究。②用于NGS的参考数据库还不够完善，大量测序数据无法进行有效匹配。③尚未开展与常规检测方法比对的规律性研究[23-24]。

综上所述，二次测序技术既是病原学诊断的一次革命，也是病原学诊断的一个界碑，具有里程碑式的意义。随着基因测序技术的不断发展，测序技术在生物学和生物医学领域应用越来越广泛，在测序数据数量和质量愈来愈高的要求下，相信基因测序技术也会持续的高速发展[25]。