PL-11多参数血小板功能分析仪与流式细胞术检测血小板聚集功能的效果比较

陈永源，周伯荣，钟广宏，李晓莹，高万里，罗建华 (广州医科大学附属第五医院神经内科，广东 广州 510700)

抗血小板治疗是心脑血管病患者重要的治疗方法。如今抗血小板药物已在临床上广泛使用，如何评价抗血小板药物的疗效及个体化治疗已逐渐成为当今医学上的热点问题。血小板的聚集功能是血栓形成的重要因素[1]。血小板的聚集功能是目前临床实践中判断血小板功能活化程度的金标准。血小板集聚功能检测有诸多方法，主要的实验室监测方法有光学法、电阻抗法、流式细胞术等，其中流式细胞术是通过测定血小板血管扩张剂刺激磷蛋白 (VASP ，Vasodilator-stimulated phospho-protein)磷酸化程度，计算出血小板反应指数(PRI，Platelet Response Index)。Montalescote等评价VASP是“ADP诱导的血小板P2Y12受体激活的最合理评价方法，是氯吡格雷药物疗效最具有特异性的监测指标”[2]。PL-11多参数血小板功能分析仪是一种最新的检测血小板集聚功能的仪器，它采用全血连续检测法对血小板计数并检测血小板聚集功能。本研究主要对流式细胞术检测VASP的磷酸化程度与PL-11多参数血小板功能分析仪使用连续血小板计数法在检测血小板聚集功能方面的效果比较，评估流式细胞术检测与连续血小板计数法在监测血小板聚集功能的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取 2015年我院就诊的缺血性卒中患者95例，其中男63 例(66.32%)，女32例(33.86%)，平均年龄(65.68 ±10.24)岁。本研究由我院伦理委员会批准，所有入组患者均要签署知情同意书。缺血性卒中诊断符合按中华医学会神经病学分会2010 年版脑梗死(动脉粥样硬化血栓形成)诊断标准，同时符合以下纳入标准:①近1年来未发生急性脑梗死且NIHSS 评分在23 分以下的患者；②年龄45～85岁之间；③近2周来未服用以下药物：氯吡格雷、阿司匹林等抗血小板药物及他汀类降血脂药物；④血小板计数处于正常范围的患者。排除标准：①近期出现严重急性脑血管病的患者；②有严重肝病或慢性肾脏病的患者；③有房间隔缺损、房颤等心脏疾病的患者；④凝血功能障碍的病人或免疫系统疾病的患者；⑤近期有行手术的患者；⑥对氯吡格雷、阿司匹林、他汀类药物不能耐受的患者；⑦近2周有服用质子泵抑制剂的患者。

1.2仪器与试剂：流式细胞仪(美国BD公司)，PGE1(前列腺素E1，法国BIOCYTEX公司)，ADP(二磷酸腺苷，流式细胞仪试剂，法国BIOCYTEX公司)，ADP(二磷酸腺苷，PL-11试剂，江苏英诺华公司)。PL-11 血小板功能分析仪(由南京神州英诺华医疗科技有限公司提供 ) 及相关配套试剂(ADP，浓度为 50 mmol/L)。

1.3方法：

1.3.1记录资料：记录入组患者的各项生命体征，抽取静脉血测定血常规、凝血功能指标、心肝肾功及电解质等指标。

1.3.2标本采集：所有入组患者服用氯吡格雷75 mg/d，服用1个月后均于清晨空腹状态下采集入组者肘静脉血 ：2管/人，用含3.8%枸橼酸钠真空采血管抽取，用于血小板VASP磷酸化检测的静脉血用含3.8%枸橼酸钠真空采血管抽取。标本保存在37 ℃的恒温箱，在2 h内完成测验,血小板VASP磷酸化检测可48 h内完成检测；检测前不能出现凝集。

1.3.3检测方法

1.3.3.1流式细胞术检测血小板 VASP的磷酸化:VASP是细胞内的一种激动调节蛋白，参与血小板的聚集活化。在基础状态下VASP呈非磷酸化状态，cAMP(环磷酸腺苷)可以通过相关反应使VASP磷酸化；患者血样本与试剂 PGE1(前列腺素E1)或PGE1+ADP( 前列腺素E1+二磷酸腺苷)一起温浴，当细胞经过透化作用后，一种特异性单克隆抗体(克隆16C2)可识别已经磷酸化的VASP ，这种特异性单克隆抗体(克隆16C2)可经过免疫荧光方法(非洗脱)被标记，经过这种间接免疫荧光方法，流式细胞仪可根据荧光的信号分析这两种形式的磷酸化水平，评估每个血样本的VASP被ADP 抑制的磷酸化活性，计算出血小板反应指数(PRI)。检测时加入PGE1或PGE1 +ADP，测试管的荧光信号后，使用校正过的荧光强度均值(MFIc)计算PRI值。血小板反应指数(PRI)=[MFIc(PGE1)-MFIc(PGE1+ADP)]/MFIc(PGE1)×100%。PRI≥50%定义为血小板高反应性[3-4]，即氯吡格雷低反应性。

1.3.3.2PL-11多参数血小板多功能分析仪用连续计数检测法原理(SPCM：Sequencing Platelet Counting Method)检测血小板聚集功能：该仪器对加入ADP试剂前后患者血小板的数目进行连续计数，通过对比加入ADP前与加入后血小板数量的变化和血小板下降的速率，来评估血小板聚集功能。血小板最大聚集率(MAR)的结果(%)=(原始血小板数-聚集后血小板数)/原始血小板数×100%。根据英诺华公司提供的标准：最大血小板聚集率≥55% 为血小板高反应性，即氯吡格雷低反应性。

2 结果

2.1两种方法结果的基本情况：PL-11血小板分析仪计算所得MAR最小值为6.30%，最大值为77.50%，平均(31.88±19.09)%，测得血小板高反应性例数为13例(13.68)；流式细胞术检测的PRI最小值为7.00%，最大值为68.00%，平均值为(31.20±15.54)%，测得血小板高反应性例数为11例(11.58%)。血小板分析仪所检测的MAR范围高于PRI，见图1。

图1 两种检测结果比较

2.2两种方法的相关性分析：有效观察值个数数值为95，两种检测方法结果经相关性分析(r=0.898，P<0.001)，说明两种检测方法存在明显相关，见图2。

3 讨论

缺血性脑卒中(ischemic stroke)的病死率高，严重影响患者的生活质量和预期寿命，可造成严重的社会经济负担[5]。抗血小板药物是防治缺血性脑卒中的关键[6]。相关研究表明，氯吡格雷可有效地降低缺血性卒中患者主要不良心脑血管事件的发生概率[7]，但有一定数量的患者存在氯吡格雷抵抗(clopidogrelresistance，CR)，即氯吡格雷抑制血小板聚集功能的作用减弱，服用常规剂量氯吡格雷时，仍会出现严重的心脑血管不良事件，从而影响了患者受益[8]。对CR的检测，关键在于血小板聚集功能检测。目前测定血小板聚集率的方法和仪器种类较多。国外曾有研究结果提示VASP是评价ADP诱导的血小板P2Y12受体激活的最合理方法，也是氯吡格雷药物疗效最具有特异性的监测指标[2]。血小板血管扩张剂刺激磷蛋白(VASP)是细胞内的一种肌动调节蛋白，VASP通过磷酸化状态参与血小板的聚集活化。VASP磷酸化时，血小板活性受到抑制，VASP去磷酸化时，可促进血小板活化。VASP的磷酸化靠cAMP(环磷酸腺苷)调节。当ADP与血小板膜上P2Y12受体结合后，可使cAMP合成减少，导致VASP去磷酸化，继而促进血小板活化。而PGE1(前列腺素E1)可使cAMP合成增多，促进VASP磷酸化，从而抑制血小板的激活。氯吡格雷经体内代谢后形成的活性物可作用在血小板膜上的P2Y12受体，特异性阻断P2Y12受体与ADP结合，从而抑制血小板活化。而且氯吡格雷活性物对基础的VASP磷酸化及PGE1刺激的VASP磷酸化无影响,但明显降低ADP对PGE1刺激 VASP磷酸化的抑制作用[9]。流式细胞仪可根据荧光的信号分析加入PGE1与PGE1 +ADP这两种形式的磷酸化水平，根据公式，计算出血小板反应指数(PRI)。应用流式细胞仪检测VASP具有以下优点检测灵敏度、特异度较高，稳定性好,室温下检测前样本可保存48 h，甚至高达72 h[10]。但其操作复杂、费用昂贵，难以应用于临床。PL-11血小板分析仪是运用库尔特原理的连续自动计数检测方法[11]，通过直接对血标本中血小板数量在诱聚剂加入后的变化进行连续检测，直接反应血小板聚集功能。作为新型检测方法，具有成本低、操作简便易行、复测方便、自动化、耗时短等优点。本研究分别通过流式细胞术VASP法和PL-11血小板分析仪检测血小板聚集功能。结果表明，PL-11血小板分析仪检测的结果与VASP法具有较好的相关性(r值=0.898)。研究提示两种检测方法的血小板聚集力分别为PL-11血小板分析仪的(31.88±19.09)%与流式细胞术VASP法的(31.20±15.54)%，使用流式细胞术VASP法的血小板聚集力的标准差较小，同时结合入组患者的血小板聚集率，考虑流式细胞术VASP法的稳定性较高，受影响因素较少。

综上所述，PL-11血小板分析仪与流式细胞术VASP法在检测血小板聚集功能时有较好的相关性，可用于临床或实验室使用的血小板功能检测方法。