黑色素瘤分化相关基因5在临床疾病中的研究进展

薛俊霞，陈亚运，谢 璐，黄俊云，刘志平

（1.赣南医学院2019级硕士研究生，江西 赣州 341000；2.中国医科大学2020级博士研究生，辽宁 沈阳 110000；3.赣南医学院基础医学院；4.赣南医学院炎症与免疫中心；5.赣南医学院第一附属医院检验科，江西 赣州 341000）

机体面临大量病原菌的威胁，当病原菌进入机体后，机体的固有免疫细胞通过其模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）识别病原体的病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）后，启动免疫级联反应，清除病原体。PAMPs 主要是指病原微生物表面某些共有的高度保守的分子结构，包括脂多糖、磷壁酸、细菌DNA、螺旋体脂蛋白、病毒RNA 等。其中病毒RNA或加工过的自身RNA由RIG-Ⅰ样受体（RIG-ⅠLike Receptors，RLRs）识别［1］。RLRs 受体包含RIG-Ⅰ和MDA5 和LGP2 三种类型［2］。其中，黑色素瘤分化相关 基 因5（Melanoma differentiation related gene 5，MDA5）由IFIH1 基因编码，广泛表达于髓系的固有免疫细胞［3］。MDA5 与RIG-Ⅰ结构相似：在N 端含有两个串联的CARD 结构域，中间是一个DECH 解螺旋酶结构域，加一个C 末端结构域（CTD）。但两者的CTD 在结构上差异较大，赋予了二者感知不同病 毒RNA 的 能 力。 与RIG- Ⅰ识 别 短dsRNA 和5‘ppp-RNA 不同，MDA5 识别长dsRNA，或者结合模拟的poly（I∶C）［双链RNA 的类似物，一条链是ploy（I），另一条链是poly（C）］。本文主要总结了MDA5的信号转导通路及其调节以及现有的对MDA5相关疾病的研究。

1 MDA5的信号转导通路

MDA5 与RIG-Ⅰ相似，通过其CTD 结构域和解旋酶结构域与长链dsRNA 结合，然后MDA5 在长dsRNA 上形成蛋白包衣的丝状物，导致MDA5 两个CARD 结构域的低聚化。随后，MDA5两个CARD 结构域与下游蛋白MAVS 的类CARD 结构域交互，激活MAVS。然后MAVS 招募TRAFs，导致某些干扰素激酶TBK1 和IKKe 的激活，使IRF3 和IRF7 磷酸化。磷酸化的IRF3和IRF7会诱导Ⅰ型IFN的产生。另一方面，招募的TRAFs 可以激活IKKα/IKKβ，导致NF-κB 的激活和抗病毒细胞因子的表达，介导先天性免疫应答。此外，抗原提呈细胞（Antigen pre⁃senting cell，APC）上的MDA5 也可以激活杀伤性T细胞，启动适应性免疫应答［4］。MDA5 通过以上多种方式参与免疫应答，应答过强或过弱都可能导致疾病产生。

2 MDA5的活性调节

2.1 共价修饰

2.1.1 磷酸化修饰二羟基丙酮激酶DAK 可特异性结合MDA5 的CARD 结构域，抑制MDA5 介导的Ⅰ型干扰素产生和抗病毒活性［5］。RIOK3 能磷酸化MDA5的Ser828抑制MDA5多聚体的发生和激活［6］。E3 泛素连接酶PIAS2β 介导MDA5 CTD 结构域的磷酸化，促进MDA5的信号激活［7］。

2.1.2 泛素化修饰TRIM65蛋白促进MDA5赖氨酸743 位点的K63 连接泛素化，促进MDA5 的寡聚化和激活［8］。此外，锌指蛋白ZCCHC3 一方面可以作为病毒RNA 和RLRs 结合的辅受体，促进RIG-Ⅰ和MDA5 对病毒RNA 的结合，也可以促进TRIM25对RIG-Ⅰ和MDA5 CARD 结构域介导的K63 连接的多聚泛素化，从而激活RIG-Ⅰ和MDA5 通路［9］。TRIM40可以通过其CC结构域与MDA5和RIG-Ⅰ的CARD 结构域结合，介导MDA5、RIG-Ⅰ的K27 位和K48 位去泛素化，抑制RLR 信号通路及IFN-β 产生［10］。

类泛素化修饰是将一个小的泛素相关修饰剂（Small ubiquitin-related modifier，SUMO）共价连接到蛋白质上。与泛素化不同的是，类泛素化不会对靶蛋白进行降解，而是调节蛋白质功能，它们参与了RIG-Ⅰ和MDA5 抗病毒信号的激活、维持和终止全过程。在未感染或病毒感染早期，由TRIM38介导的RIG-Ⅰ和MDA5 的类泛素化抑制了它们K48-多聚素依赖的降解，稳定了传感器蛋白，使通路持续激活。在感染的后期，由Sentrin/SUMO-specific protease 2（SENP2）对RLRs 进行去类泛素化，触发其蛋白酶体降解，促进炎症终止［11］。

2.2 MDA5 的反馈调节MDA5 存在反馈调节，MDA5 作为干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes，ISGs），自分泌或旁分泌的IFN-α/β 能通过Jak-Stat信号通路上调自身的表达。也有研究发现，MDA5的表达受IRF-3的严格调控，用仙台病毒刺激IRF3 基因敲除的树突状细胞发现正常会上调的MDA5因IRF3基因的敲除不再上调［12］。

2.3 受体间的相关激活LGP2 作为RLRs 家族的成员蛋白，含有具有ATP水解活性的中央DeCH-box解旋酶结构域和羧基末端结构域，参与RNA 结合和构象重排，但LGP2 缺乏氨基末端串联Caspase 激活和募集域，因此缺乏独立的信号转导活性。LGP2能正向和反向调控RIG-Ⅰ和MDA5 的活性。LGP2 通过协同结合促进双链RNA（dsRNA）上MDA5寡聚成核，激活MDA5 通路［11］。动物实验证实，缺乏LGP2的小鼠对某些以MDA5 识别并清除的RNA 病毒［如脑心肌炎病毒（EMCV）］不能触发有效的免疫应答［13］。

因此，MDA5 信号激活需要磷酸化、泛素化、类泛素化等多种共价修饰以及下游分子的反馈调节、受体间的相互激活等多种调节。调节过强、过弱或异常调节都有可能导致疾病的发生。因此弄清楚MDA5信号通路正常和异常情况下的信号修饰和调节，对各种疾病的诊断和治疗具有重要意义。

3 MDA5与临床相关疾病

3.1 MDA5与感染

3.1.1 MDA5 在病毒感染中的作用MDA5 主要识别长链dsRNA，即呼肠病毒科病毒。MDA5 还可识别某些ssRNA，如微小核糖核酸病毒科病毒（脑心肌炎病毒、鼻病毒、B 型科萨奇病毒）、黄病毒科病毒（丙型肝炎病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒）、部分dsDNA 病毒（痘病毒、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒）。识别病毒后引起上文提到的信号通路激活。下面从病毒引起的大的疾病类型方面概述MDA5在感染中的作用。

3.1.1.1 呼肠病毒科病毒当呼吸道肺上皮细胞感染病毒后，MDA5 能特异性结合呼吸道感染病毒中的副黏病毒V 蛋白，RIG-Ⅰ对IRF-3 的初始激活后，防止IRF-3 的早期降解，从而维持IRF-3 依赖的抗病毒基因的表达［14］。

MDA5 应答的另一大类病毒是肠病毒。它们主要在肠道内繁殖，再从粪便中排出，但很少引起胃肠道的症状。这大家族的病毒可引起多种多样的疾病，如脊髓灰质炎病毒可引起脊髓灰质炎（俗称小儿麻痹）；肠道病毒71型可引起“手足口病”；柯萨奇病毒可引起心肌炎、流行性肌痛、疱疹性咽峡炎、手足口病和脑膜炎。使用Mda5−/−敲除小鼠实验和其他多种方法发现，MDA5信号对小核糖核酸病毒（如脑心肌炎病毒、鼠脑脊髓炎病毒、脊髓灰质炎病毒和柯萨奇B 病毒）诱导Ⅰ型IFN 产生至关重要［15-19］。此外在多种细胞模型中发现MDA5能有效抑制戊型肝炎病毒、人类诺如病毒和轮状病毒肠病毒复制。一方面MDA5 过表达可通过类似IFN 的反应诱导重要的抗病毒ISG 的转录，而不触发功能性IFN 的产生；另一方面MDA5 通过激活STAT1 进而启动JAK-STAT 级联通路，触发抗病毒IFN 反应。即证明MDA5 通过引起非典型的IFN 样应答（部分依赖于JAK-STAT 级联反应）有效抑制这几种病毒的复制。此外也有研究指出诺如病毒（MNoV）感染的小鼠能在血红素氧化的IRP2 泛素连接酶1（HOIL1，线性泛素链组装复合物的组成成分之一）参与下，通过MDA5 信号途径，诱导树突状细胞Ⅰ型和Ⅲ型IFNs的产生，抵抗病毒感染［20］。

3.1.1.2 肝炎病毒此外，MDA5在抵抗多种肝炎病毒感染中也有重要作用，将HBV复制质粒与RIG-Ⅰ或MDA5表达质粒共转染Huh7细胞，发现MDA在相似的蛋白水平时，更能显著地抑制HBV 的复制。对Mda5−/−小鼠进行感染，结果显示，Mda5−/−小鼠表现出比WT小鼠更强的乙型肝炎病毒复制，即MDA5能识别乙型肝炎病毒并激活先天免疫信号以抑制病毒复制［21］；而通过对慢性乙型肝炎患者MDA5 和RIG- Ⅰ的mRNA表达量分析，发现MDA5基因表达下调可能是导致慢性乙型肝炎患者HBV持续存在的原因之一［22］；此外，MDA5也参与对丙型肝炎病毒ssRNA和丁型肝炎病毒dsRNA的识别过程，并负责介导大量IFN-β和IFN-λ的产生［23-24］。

3.1.1.3 冠状病毒MDA5 提供诱导Ⅰ型IFN 产生参与机体对冠状病毒感染的应答过程。MDA5在本世纪发生的两种严重冠状病毒感染疾病——MERS 和SARS 中都发挥了关键作用［25］。最新研究表明，MDA5 也参与对新型冠状病毒（COVID-19）的应答过程，通过对COVID-19 的重要中间宿主穿山甲的RNA 感受器基因进行基因组学比较，发现除MDA5 识 别Z-DNA 和Z-RNA 的Z-DNA 结 合 蛋 白（ZBP1）外，其他RNA感受器高度保守。从而提出假设，MDA5 和ZBP1 的缺失导致穿山甲对COVID-19感染由抵抗转变为耐受［26］。进一步对临床患者进行分析发现COVID-19 与抗MDA5 综合征的全身体征、病理生理机制、致死原因相似。当对COVID-19患者应用抗MDA5综合征药物时可更快地改善病症并显著提高生存率，即COVID-19 患者临床表现和用药选择与患有抗MDA5 综合征患者具有相似性［27-28］。

MDA5 作为先天性模式识别受体，在识别和应答dsRNA 病毒、某些ssRNA 病毒和部分dsDNA 病毒中发挥重要作用，参与抵抗呼肠病毒科病毒、肝炎病毒、冠状病毒等多种病毒感染过程。综上所述，MDA5是应对多种病毒感染重要的先天性模式识别受体。

3.1.2 MDA5 在真菌感染中的作用侵入性真菌感染每年造成150 万人死亡，超过90% 报告真菌感染相关死亡是由隐球菌、念珠菌、曲霉菌、肺孢子菌这四种真菌引起［29］。

3.1.2.1 MDA5 在曲霉菌感染中的作用侵袭性肺曲霉病（Invasive pulmonary aspergillosis，IPA）是一种危及生命的疾病，研究证明，依赖MDA5/MAVS的Ⅲ型干扰素和部分Ⅰ型干扰素应答对于诱导中性粒细胞杀死烟曲霉菌孢子至关重要［30］。

3.1.2.2 MDA5 在念珠菌感染中的作用念珠菌是院内（医院获得性）血流感染的第四大常见原因［31］。当用白色念珠菌菌丝刺激体外培养的巨噬细胞时，巨噬细胞MDA5 的表达量增加。对应的临床分析发现，慢性黏膜皮肤念珠菌病（Chronic mucocutaneous candidiasis，CMC）患者表达的MDA5水平低于健康对照组，其次，IFIHI 基因的错义突变与系统性念珠菌感染的易感性之间有很强的联系。当用白色念珠菌酵母或菌丝刺激Mda5−/−小鼠的脾细胞发现IFN-β、IL-6、IL-10 表达低于野生型（WT），而具有假丝酵母菌风险等位基因的人外周血单核细胞会产生更多的促炎细胞因子（IFN-γ和IL-17）和更少的抗炎因子IL-10，提示MDA5 可能在白色念珠菌感染期间至少部分负责Ⅰ型IFN 的诱导，引起免疫紊乱。但具体机制未知［32］。

综上所述，MDA5 作为病毒RNA 识别受体，也能对曲霉病、念珠菌等真菌产生应答，MDA5能诱导Ⅲ型干扰素和部分Ⅰ型干扰素的表达，激活中性粒细胞抵抗曲霉菌感染。MDA5也参与白色念珠菌感染的免疫应答，但发挥的作用和作用机制仍需进一步研究。

3.2 MDA5 在自身免疫性疾病中的作用 有文献指出，MDA5 的功能获得性突变会使Ⅰ型IFN 表达升高，导致自身免疫病［33］。而通过运用MDA5 过表达转基因小鼠实验，发现自发的MDA5 激活导致的MDA5 过表达仅引起慢性Ⅰ型IFN 呈表达状态，并不足以引发自身免疫性或病理性炎症。只有结合像FcgR2B 缺陷的狼疮性综合征等易感背景时，MDA5过表达才能加速自身抗体的产生［34］。

3.2.1 Aicardi-Gtières 综合征 逆转录元件Alu作为逆转座子，能在DNA 某特定插入位点产生短的正向重复序列。Aicardi-Gtières 综合征中MDA5 的结构性激活是由于对Alu 逆转录元件形成的细胞dsRNA 失去耐受性所致［35］。也有研究指出，Aicardi-Gtières 综合征相关的MDA5 基因突变是因为MDA5解旋酶结构域中单个氨基酸的替换，使突变的MDA5 以一种独立于RNA 的方式构成信号，在缺乏外源刺激的情况下也能激活IFN-β 启动子［36］。也有研究指出，MDA5 有些突变增强了它与RNA 之间的相互作用，针对细胞自身RNA 触发信号，增强Ⅰ型IFN的响应［37］。

3.2.2 皮肌炎有研究表明，抗MDA5抗体与一种导致皮肤和肌肉炎症的罕见疾病—— 皮肌炎（Dermatomyositis，DM）密切相关，在亚洲人群中20%~50% 的DM 患者有抗MDA5 抗体。有研究显示，抗MDA5 抗体对DM 诊断的敏感性为18%，特异性达100%，表明抗MDA5 抗体对DM 有一定诊断价值［38］。表现为抗MDA5阳性的DM患者血浆中IFN⁃α的蛋白水平远高于其他DM 亚型患者，其皮肤活检以STAT1、ISG15 和MxA 蛋白的强表达（存在）为特征［39］。

3.2.3 1 型糖尿病 有研究表明，MDA5 与1 型糖尿病也有很强的相关性。 1 型糖尿病（Type 1 diabetes，T1D）是一种与炎症强烈相关的慢性自身免疫性疾病。β 细胞和免疫细胞释放的细胞因子和趋化因子以及死亡的β 细胞传递的免疫信号可以诱导并增强胰岛炎症，而胰岛炎症可进一步发展为临床糖尿病。MDA5可通过识别人工合成的双链多聚肌胞酸［polyinosinic-polycitidiic acid，poly（I∶C）］诱导细胞因子和趋化因子的表达，而沉默MDA5 可减少PIC 诱导的细胞因子和趋化因子的量，从而抑制胰岛炎症［40］。功能受抑制的MDA5 基因突变，可使T1D 的风险降低近50%［41］。5 个与编码MDA5 相关的独立的单核苷酸多态序列可看作1型糖尿病相关基因［42］，且MDA5 能作为MDA5 相关1 型糖尿病临床预后指标［43］。

3.2.4 白癜风MDA5 通过诱导角质形成细胞在病毒入侵时分泌趋化因子而加重白癜风。白癜风是一种皮肤自反应性CD8+T 细胞浸润而杀死黑色素细胞为特征的毁容疾病。大量研究表明，病毒入侵参与了白癜风的发病机制，IFIH1 已被鉴定为白癜风易感基因。病毒入侵显著激活了MDA5，增强了角化细胞衍生的CXCL10 和CXCL16，这两个趋化因子在CD8+T 细胞浸润白癜风皮肤中起重要作用。MDA5可作为病毒侵袭导致的白癜风的潜在治疗靶点［44］。

综上所述，MDA5 的基因突变和功能异常会导致多种自身免疫性疾病的发生，MDA5 的基因测序和相关抗体检测在相应疾病的诊断和预后预测中具有重要价值。进一步研究各种抗MDA5阳性的自身免疫病的发病机制，有利于针对各种自身免疫病的特性开发有效药和特效药。

3.3 MDA5在癌症中的应用

3.3.1 MDA5 参与的癌症MDA5 在癌细胞中识别病毒RNA 模拟物并激活线粒体凋亡途径［45］。MDA5 异位表达导致多种细胞包括癌细胞生长停滞［46］，在黑色素瘤细胞系中，MDA5/MAVS/Caspase-9和Apaf-1 信号通路激活，产生并介导独立于Ⅰ型IFNs 和p53 促凋亡信号通路的促凋亡蛋白Noxa，而非恶性细胞可通过上调Bcl-xL，免于MDA5 诱导的凋亡。因此，细胞质的MDA5/MAVS 通路的激活会在Bcl2 家族蛋白调节下引起黑色素瘤细胞特异性凋亡［47］。胰腺癌细胞凋亡也有MDA5/MAVS 途径的参与，poly（I∶C）激活MDA5，导致转录因子IRF3 磷酸化，IFN-β 产生，MHC-Ⅰ表达上调，诱导凋亡。MDA5信号也通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活Caspase诱导肿瘤细胞凋亡，并使肿瘤细胞对外源性Fas 介导的凋亡更加敏感。用MDA5 配体全身治疗原位胰腺癌小鼠时，可更多地激活肿瘤抗原特异性CD8+T 细胞，并在肿瘤微环境中形成免疫原性细胞因子。 在两种不同的胰腺癌小鼠模型也证实，MDA5通过CD8+T细胞诱导肿瘤细胞凋亡并显著延长生存期［48］。利用含活性突变Ras的人胰腺癌和结直肠癌细胞证明Ras/Raf/MEK/ERK 通路的激活可抑制MDA5介导的人胰腺癌和结肠直肠癌细胞促凋亡的活性，而当应用Ras/Raf/MEK/ERK 通路分子抑制剂，MDA5 的促凋亡活性升高［46］。在神经母细胞瘤中，MDA5 可与TLR3 协同作用抑制肿瘤的发展，其中，MDA5 的过表达会减弱癌细胞的增殖［49］。此外，MDA5 也参与肝癌细胞凋亡，MDA5 可上调激活Caspase3/7 途径诱导肝癌细胞凋亡，poly（I∶C）脂质体通过激活MDA5抑制小鼠肝癌细胞的生长［50］。

3.3.2 MDA5 在临床抗肿瘤治疗中的应用临床的抗肿瘤DNA 去甲基化剂5-AZA-CdR 能模拟逆转录病毒侵入肿瘤起始细胞诱导dsRNA 的形成过程，激活MDA5/MAVS/IRF7 级联信号，从而刺激Ⅲ型干扰素而不是Ⅰ型干扰素的产生，有效诱导抗增殖反应。短期低剂量5-AZA-CdR 可显著降低小鼠肠道肿瘤起始细胞的发生频率［51］。使用人工合成的RNA 如poly（I∶C）激活MDA5 或使用腺病毒载体过表达MDA5 都可激活MDA5 下游信号通路促进抗肿瘤免疫，诱导癌细胞死亡［52-53］。以上结果提示，IFIH1 基因型和MDA5 表达水平可能在预测患者对靶向表观遗传调控药物的反应具有指导意义。综上所述，MDA5在黑色素瘤、胰腺癌、结直肠癌、神经母细胞瘤和肝癌等癌症中抗癌细胞免疫和诱导癌细胞凋亡的特性正在被用来开发成各种癌症的潜在治疗手段，如肽疫苗在使用poly（I）CLC 佐剂进行两次连续免疫后会通过刺激TLR3和MDA5表达，产生大量内源性肿瘤反应性杀伤性T细胞（CTL）［4］。

4 结论与展望

MDA5 信号通路激活可触发先天性免疫应答和获得性免疫应答，发挥抗感染作用。当机体产生肿瘤细胞时，MDA5可触发抗肿瘤免疫，抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡，当MDA5 调控异常，产生大量Ⅰ型干扰素时，会导致多种自身免疫病的发生。所以，了解机体生理病理状态下MDA5 信号通路的激活和调控机制，对疾病的致病机制、治疗方法的研究有重要意义。