脊髓损伤后神经细胞死亡机制研究进展

张 放，张子良，洪健焜，刘宏发，黄 樱

（1.赣南医学院2019级硕士研究生；2.赣南医学院2018级硕士研究生；3.赣南医学院第一附属医院神经内科，江西 赣州 341000）

脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）是一种主要由车祸、坠落伤等所致神经功能不同程度障碍的疾病。据统计，2016年仅美国就有28.2万人患有SCI，并且以每年1.7 万例的数量在增长［1］。因此深入探究SCI 的病理生理机制，对研究有效的治疗手段有重要意义。SCI 分为原发性和继发性损伤两个阶段，原发性SCI是指最初的机械性组织损伤，它包括脊髓微血管破裂，组织的出血、水肿。SCI 后的继发性损伤包括一系列的生化和细胞事件，如大量神经细胞死亡、轴突破裂和神经传导通路破坏等［2-3］。抑制或者减少神经细胞死亡，是促进SCI 恢复的主要策略。本文就SCI 后神经细胞死亡方式及特点、调节机制、干预靶点等进行综述，以期为探究SCI的治疗方法提供思路。

1 凋 亡（Apoptosis）

凋亡是最早被人类发现且目前研究最为明确的一种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cysteinyl aspar⁃tate specific proteinase，Caspase）依赖的程序性细胞死亡方式。有研究报道，细胞凋亡广泛存在于中枢神经系统损伤中，包括脑卒中和SCI 等［4］，对SCI 动物模型的研究发现，凋亡发生于神经细胞中［5］。

经典的细胞凋亡通路有两种：一种是由Caspase-9启动，依赖于线粒体释放因子的内源性凋亡。另一种是由死亡受体介导的，通过激活Caspase-8触发的外源性凋亡。最终，这两种凋亡途径均由Caspase-3执行。凋亡被认为是SCI后神经细胞损伤的重要机制之一［6］，很多研究者都以细胞凋亡途径为靶点，探讨保护SCI 的可行策略。JIA Z Q 等［7］实验表明，伊布硒可通过改变SCI 后Bcl-2/Bax 蛋白的比值，降低Caspase-3 的活化，从而抑制线粒体凋亡通路，减轻SCI 引起的继发性损伤，发挥其对脊髓的保护作用。另有研究发现，Caspase-9 抑制剂z-LEHD-fmk 也可以有效地阻止凋亡，并对损伤的大鼠提供神经保护［8］。

此外，内质网膜上的Caspase-12 可被凋亡早期升高的钙离子激活，活化的Caspase-12 转运到细胞质中参与内源性凋亡过程。针对这一机制，近期就有研究应用成纤维细胞生长因子22 抑制内质网应激诱导的神经细胞凋亡，促进了大鼠SCI 的恢复［9］。ZHAO L 等［10］发现，右美托咪定可通过降低SCI后大鼠Caspase-12表达，抑制内质网参与的凋亡通路，从而对SCI 后继发性损伤提供神经保护。但是，目前所有抗凋亡治疗对SCI 具有神经保护的证据，均停留在动物实验层面，尚缺乏相关的临床试验验证。

2 坏死（Necrosis）和坏死性凋亡（Necroptosis）

坏死在SCI 中是由物理、化学等伤害所致的不可调控的细胞死亡［5］，其主要途径为：（1）脊髓暴力损伤后直接导致神经细胞完整性受损；（2）SCI 后局部组织缺血水肿，细胞外液代偿性流入细胞内，导致神经细胞水肿、破裂。与细胞坏死不同的是，坏死性凋亡是通过Caspase-8、受体相互作用蛋白激酶1（Receptor interacting protein kinase 1，RIPK1）和RIPK3来控制和调节的程序性细胞死亡。在死亡受体与其配体结合的刺激下，去泛素化的RIPK1 可诱导Caspase-8 介导的凋亡途径。当Caspase-8 被抑制或缺失时，RIPK1 通过C 端的RIPK 同型相互作用基序结构域与RIPK3结合，形成RIPK1/RIPK3复合物。该复合物激活混合系列蛋白激酶样结构域（Mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）并触发坏死性凋亡［11-12］。坏死性凋亡虽然与我们传统认识的坏死不同，但形态学特征与其相似：细胞完整性受损、细胞内容物流出、染色质凝集等。它已被证实涉及许多病理过程，如肾、脑等的缺血再灌注损伤［12］，同时也被发现参与SCI 的病理过程。LIU M等［13］研究发现，在成年小鼠SCI 模型中坏死性凋亡可导致SCI后早期神经细胞损伤，甚至死亡。

现已清楚，RIPK1 在坏死性凋亡中起着重要的调节作用。有学者应用靶向RIPK1 的坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1 治疗大鼠SCI，发现可减少SCI区域的组织损伤，并且通过行为学表现证实了Necrostatin-1 对大鼠脊髓生理功能的改善和神经保护作用［14］。然而RIPK1 可能只参与了某一种刺激诱导的坏死性凋亡，而RIPK3 可单独启动坏死性凋亡［12］，有研究发现，RIPK3在受损脊髓的各种神经细胞中表达显著升高，并可在损伤后3天达到峰值［15］。另外，最新的实验用RIPK3 抑制剂处理SCI 小鼠，发现其可改善小鼠的运动功能，但并不完全［16-17］。提示RIPK3 并不是坏死性凋亡的唯一调节通路，也说明可能有更多的机制参与SCI的调控。

3 焦 亡（Pyroptosis）

焦亡是一种依赖于Gasdemin 蛋白家族成孔活性的细胞炎症性死亡方式。SCI 所致的原发性和继发性神经细胞损伤，均包含炎症性损伤过程。在SCI 早期以神经细胞坏死和凋亡为主要现象，之后炎症应激引起的焦亡可加重继发性损伤［18］。

焦亡主要有两条途径介导：一种是经典的细胞焦亡途径，主要是模式识别受体被危险信号分子刺激，通过凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis associated speck-like protein containing a CARD，ASC）招募procaspase-1 组装形成炎症小体，激活Caspase-1 后进一步切割Gasdemin 目的蛋白，引发焦亡。其中，与中枢神经系统相关性最强的炎症小体是Nod样受体家族蛋白1（Nod-like receptor protein 1，NLRP1）和NLRP3 两种［19］。SCI 可 促进脊 髓 神经细 胞 中NLRP1、ASC 和Caspase-1 的表达［20］。LIN W P 等［18］在大鼠SCI 模型的研究中发现，血红素加氧酶-1 可有效减低NLRP1表达，减轻NLRP1炎性小体诱导的神经细胞死亡。NLRP3也被发现表达于SCI大鼠神经细胞中［21］。

另一种细胞焦亡途径是在细胞质的脂多糖（Lipopolysacchanrides，LPS）刺激下，LPS的保守结构脂质A 与Caspase-4、5、11结合，活化了的Caspase-4、5、11 可进一步切割Gasdemin 蛋白，促进焦亡发生［22］。在LPS 发挥免疫应答的过程中，Caspase-11的激活还能导致缝隙连接蛋白1（Pannexin-1）断裂并形成通道，把ATP 释放到细胞外，并作用于嘌呤能受体7（Purinergic receptors 7，P2X7），进而使钾离子、钠离子、钙离子外流，从而打破胞膜内外离子平衡，使细胞发生渗透性损伤，导致细胞死亡［23］。并且有研究发现利用P2X7 受体抑制剂可减轻SCI 大鼠的组织损伤并促进运动功能的恢复［24］。

但是，目前针对SCI后的细胞焦亡，大多数研究的重点是寻求合适的治疗方案对抗炎症小体介导的炎症反应。DAI W 等［25］研究发现SCI 大鼠腹腔注射雷公藤红素可减少小胶质细胞NLRP3、ASC、Caspase-1的表达，抑制焦亡途径，减轻急性期炎症反应，进而促进SCI大鼠神经功能的恢复。ZENDEDEL A等［21］发现，雌激素可减弱ASC、NLRP3、Caspase-1 等炎症小体成分的表达；并在组织病理学水平上发现，雌激素处理组的大鼠脊髓小胶质细胞和少突胶质细胞损伤得到改善。也有研究发现，槲皮素能抑制SCI大鼠NLRP3炎症小体的激活，减弱组织损伤，促进神经功能恢复［26］。高压氧疗法也被证实是一种有效的方法，其机制是能降低SCI 模型大鼠中NALP3（同NLRP3）、ASC 和Caspase-1 的mRNA 和蛋白表达水平，并且可减轻SCI 诱导的IL-1β 的释放，进而发挥减轻SCI 的作用［27］。最近的一项调查发现，减少炎症浸润对促进受损中枢神经系统神经细胞的再生有一定作用［28］。炎症反应在SCI过程中是一把“双刃剑”，既可以促进轴突再生，又可以加重神经损害［29］。所以研究中需要不断优化治疗过程，使炎症的不利方面减少到最小，有益方面增加，而不是完全抑制炎症反应的发生［25］。

4 自 噬（Autophagy）

自噬是一种受到严格调控的生理过程，它能在细胞成分的生产、受损细胞器和其他有毒细胞成分降解之间保持平衡［30］。自噬的整个过程被称为自噬通量，它代表了自噬从细胞内容物被隔离到降解的整个动态过程。自噬通量是衡量自噬降解活性的一种方法，增强自噬通量的干预措施可能在SCI模型中提供神经保护作用。

自噬标志物包括自噬相关基因微管相关蛋白1轻 链3- Ⅱ（Microtubule ⁃ associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、Beclin-1、p62 和自噬体，各标志物在SCI 实验动物模型中的表达模式尚不统一。在SCI 实验动物模型中，一些研究报道了自噬小体标志物LC3- Ⅱ在SCI 后24 h 内表达就显著升高［31-32］，而另一些研究只检测到该标志物在损伤后3～7 d 才升高［33-34］，这可能与实验模型、损伤程度不同有关。有研究发现启动自噬的重要蛋白Beclin-1在SCI 后表达增加［35］，然而也有研究报道在SCI 后Beclin-1 和其他自噬的上游介质和调节因子的水平没有改变［32-33］。p62 的含量通常被用来描述自噬的降解率，低水平的p62蛋白与高自噬通量相关（促进降解），而高水平的p62 蛋白与低自噬通量相关（抑制降解），并且很多研究都报道了p62在受损脊髓组织中的积累［31-33］。

在SCI 中，不同神经细胞对自噬反应不同。在大鼠的挫伤SCI模型中，与背角感觉神经细胞相比，腹角运动神经细胞中LC3 和p62 的积累量大，尽管背角感觉神经细胞更靠近撞击部位［31，33］，这提示运动神经细胞可能相对更容易受到自噬通量的破坏。另外，SCI 后自噬体在小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞中均有数量增加的报道［32-33，36］。

自噬在SCI 后的继发性损伤和功能恢复中的作用仍不明确，一些实验结果表明，自噬在SCI中具有促进和阻碍的双重作用［37］。在体内用于控制自噬的最常见药物是用于增强自噬的雷帕霉素靶向蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制剂——雷帕霉素。一般来说，促进自噬通量的药理学调节已被证明在脊髓损伤中提供神经保护。但是另一方面mTOR的活性在少突胶质细胞分化和髓鞘形成中起关键作用，并参与轴突的发芽［38］，这两者都是SCI 后脊髓功能恢复所必需的。因此，对于SCI，抑制mTOR 可能不是最佳的治疗方法。与此相一致，一些研究报道了雷帕霉素对SCI 后的功能恢复没有影响［36］。海藻糖是一种天然存在的含有两个葡萄糖分子的糖，被报道为一种新型的与mTOR无关的自噬增强剂，且已被证明在家兔脊髓缺血损伤模型中有神经改善作用［39］。另外，海藻糖还可以独立于自噬而减轻损伤和促进恢复［40］。然而，海藻糖是否能够克服SCI 后自噬通量的阻滞，改善神经细胞功能，还有待进一步研究。

5 铁死亡（Ferroptosis）

铁死亡是一种新发现的依赖铁和活性氧（Reac⁃tive oxygen species，ROS）生成的细胞死亡形式，其特征是脂质过氧化物积聚到致死水平［41］。谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4，Gpx4）在铁死亡途径中起着关键作用，它能将有毒的脂质过氧化物转化为无毒的脂醇。谷氨酸/半胱氨酸反转运系统（System Xc-light chain，xCT）是参与半胱氨酸运输的逆向转运体，半胱氨酸是谷胱甘肽（Gluta⁃thione，GSH）合成的重要原料。GSH 是Gpx4 的还原剂，当Gpx4 失活，会出现ROS 聚集，脂质过氧化，引发细胞铁死亡［41-42］。另一方面，铁过载会通过激活脂氧合酶（Lipoxygenases，LOX）或芬顿反应来促进脂质过氧化物的产生，从而诱发铁死亡。LOX 的底物是膜磷脂，特别是含有花生四烯酸或肾上腺素的磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamines，PEs）。这些分子的合成依赖于辅酶A与多不饱和脂肪酸的结合，多不饱和脂肪酸主要由酰基辅酶A 合成酶长链家族成员4（Acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（Lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）这两个可引起铁死亡的重要因子降解［41-42］。

在原发性SCI 中有出血和活性氧（Reactive oxy⁃gen species，ROS）聚集［43］，由于出血损伤部位出现铁过载［44］，且脊髓有高含量的多不饱和脂肪酸，其脂质过氧化反应可导致SCI［45］。以上现象都提示了SCI 中存在着铁死亡。ZHANG Y 等［46］首先发现SCI后的脊髓组织中有铁死亡的特征性形态表现：线粒体皱缩、嵴减少或消失，并且SCI时铁死亡的负向调控因子Gpx4、xCT 表达下调，代表脂质过氧化水平的四羟基壬烯（4-hydroxynonenal，4HNE）上调。证实了SCI中存在着细胞铁死亡。

鉴于铁死亡参与SCI 的病理过程，以铁死亡通路为靶点研发SCI的治疗途径很有前景。其中铁死亡特异性抑制剂是否能促进脊髓修复是研究重点。Ferrostatin-1 是第一代铁死亡抑制剂，在体外被证明能有效地抑制铁死亡［47］。然而，由于血浆和代谢的不稳定性，导致它在体内的功能很弱。SRS16-86 作为第三代小分子铁死亡特异性抑制剂，稳定性高，可抑制脂质ROS［46］。最新的研究将SRS16-86 注射到SCI大鼠中，发现其可促进大鼠SCI后运动功能恢复，增加神经细胞存活率，降低胶质增生和炎性细胞因子的表达水平［46］。另外，YAO X 等［48］也证实了铁螯合剂去铁胺可以通过抑制铁死亡来修复大鼠SCI。以上实验均表明，铁死亡抑制剂在SCI 的修复中有保护作用，但这些研究尚处在实验室阶段，需要有更多的体内实验及临床数据的支持。

6 总结与展望

SCI 后多种神经细胞死亡方式的参与是造成机体神经功能缺损的重要原因，各种死亡方式的分子机制既有不同又有交织，例如凋亡和自噬就有许多共同的调节因子，抗凋亡的Bcl-2蛋白不仅能抑制促凋亡蛋白下调凋亡的活性，而且还能与Beclin-1 相互作用负向调节自噬［49］。此外Caspase-8 作为外源性凋亡的启动子，同时还是控制着细胞坏死性凋亡和焦亡的分子开关［50］，铁死亡在某些条件下也伴随着自噬的发生［51］。目前针对各种死亡方式的靶向性治疗仍在实验研究中，尚未进入临床研究。但是面对SCI，有效的神经保护策略需要充分考虑各种死亡方式在其中的地位、交互作用以及时序关系。