从临床前和临床研究谈肝癌免疫治疗新进展

蒋贝格 周伟平

肝细胞癌(HCC)是世界范围内致死率最高的恶性肿瘤之一，目前尚无针对发病机制为基础的有效治疗[1]。HCC对化疗不敏感，且手术切除、局部射频消融等治疗效果有限[1]。虽然，目前已有不少治疗肝癌的靶向药物出现，譬如索拉非尼(Sorafenib)、仑伐替尼(lenvatinib)，但治疗效果非常有限，也仅延长了患者几个月的生存期[2,3]。因此，随着免疫检查点抑制剂(ICIs)在晚期黑色素瘤或肺癌上取得不错效果后，ICIs在未进行临床前试验的情况下，随即进入临床试验治疗晚期肝细胞癌。结果显示，药物的毒性和安全性可控，但治疗效果相对有限，治疗反应率不高。因此，一个亟待解决的问题出现了，那就是如何把肝脏肿瘤从“冷”向“热”，或者说有不错反应率的肿瘤转变，这需要深度的动物模型机制研究和大样本的人体试验数据。

近年来，随着免疫抑制共受体在T淋巴细胞中被发现，通过增强免疫抑制肿瘤才取得真正的突破。比如，在预先皮下注射了结肠肿瘤51BLim10细胞或Sa1N纤维肉瘤细胞的小鼠腹腔内注射抗CTLA-4抗体，而非抗CD28抗体，抑制了小鼠体内的肿瘤生长[4]。细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA-4)，又称为CD152，通过与CD28的配体CD80(B7-1)和CD86(B7-2)结合，负向调节T细胞活性[4]。程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)通过与其特异性配体PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)相互作用，抑制T细胞的活性和增殖[5]。Honjo等在小鼠体内证实，P815肥大细胞瘤表达程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)后能显著增强细胞的成瘤性和侵袭性[5]。这些开创性的研究表明，通过阻断免疫抑制信号可以抑制肿瘤。很快肿瘤免疫疗法进入临床试验。一家创新型小公司Medarex研制了人源化的抗PD-1抗体(nivolumab)。2006年，被美国FDA批准进入临床试验，2008年日本也开展相关临床试验。到2012年，人源化的抗PD-1抗体治疗非小细胞型肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌的I期临床试验结果被相继报道[6]。当这种肿瘤免疫疗法成功地挽救了一些晚期转移性黑色素瘤和肾癌的患者时，全世界都为之兴奋。2013年Science杂志将肿瘤免疫治疗评选为当年的十大科学突破。本文将重点回顾阐述动物模型结合临床前研究以及临床试验研究在促进HCC免疫治疗中的价值。

一、ICIs在肝癌患者中的临床试验

2013年，Sangro等报道了CTLA-4抗体(tremelimumab)治疗HCC的无对照、开放标签、多中心的II期临床试验[7]。该临床试验在20例由丙型肝炎引起肝硬化最终发展成为HCC患者身上进行，结果显示CTLA-4抗体有抗肿瘤和抗病毒效应，且药物的不良反应可控。2017年，El-Khoveiry[8]报道了其与多名全球合作者共同开展了一项抗PD-1抗体(nivolumab)治疗晚期HCC(CheckMate040)的开放标签，非比较性的I/II期临床试验(NCT01658878)。该临床研究共招募262例多病因导致的晚期HCC患者。结果表明，无论是否接受过索拉非尼治疗，nivolumab都有不错反应率和总体生存时间，且药物安全可控。

一项非随机，开放标签的II期临床试验(Keynote-224)评估了抗PD-1药物pembrolizumab治疗104例接受过索拉非尼治疗的晚期HCC患者的安全性和有效性，结果表明，Pembrolizumab也没有发现严重的安全性和毒性的事件[9]。对这些HBV或HCV感染史且索拉非尼治疗后发生病情进展的HCC患者的客观反应率为17%。最常见的免疫相关不良反应有甲状腺功能减退，肾上腺功能不足，以及甲状腺炎，这些不良反应与Pembrolizumab治疗其他肿瘤出现的一样。PD-L1在肿瘤和免疫细胞中的联合表达可预测pembrolizumab的反应性。20%(6/30)低表达的PD-L1的患者，也对抗PD-1治疗有效。全球，仍有很多ICIs治疗HCC的临床试验正在开展中，每年都有新的临床试验结果出来。其中包括两个二线治疗晚期肝癌的III期临床试验(KEYNOTE-240和KEYNOTE-394)。不少临床试验旨在评估抗CTLA-4和PD-1或PD-L1联合其他药物或者物理治疗的联合治疗策略[10]。

二、肝脏中的特殊免疫微环境

最初的临床试验结果显示，免疫治疗在HCC中展现出较低的反应率和有限的治疗益处[8, 9]。因此，在探讨可能影响临床结果的分子、细胞因素时，不能忽视肝脏免疫耐受。肝脏在免疫调节中起着重要的作用。从肠道，除了营养物质外，肝脏还获得能被肝脏独特的“肝窦”结构有效识别、加工或清除的物质，包括微生物、微生物相关分子模式(MAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)。相应地，肝窦内皮细胞(LSECs)表达一系列模式识别受体(PRRs)，负责清除血液中的可溶性大分子和胶状废物[11]。另外，肝脏里常驻着数量最多的库普弗细胞，它们也表达多种类型的PRRs，通过吞噬作用识别和清除不溶性的废物。肝脏的另外一个显著特征是富含NK，NKT和TCRγδT细胞，以及相对外周血CD8+/CD4+T细胞比例更高。

肝脏最重要的免疫特性之一是诱导T细胞耐受导致肝脏免疫耐受，从而防止对从肠子吸收的抗原的过激免疫反应。虽然，潜在的机制仍有待阐明。肝脏的免疫抑制环境显然是由原始T细胞、LESCs、树突状细胞，枯否氏细胞和肝细胞通过促炎和抑炎细胞因子的相互协调维持的[12]。肝脏T细胞的耐受是在缺少共刺激因子和CD4+细胞数量少，或由枯否氏细胞分泌的IL-10刺激导致的Treg细胞扩增的环境下被持续的抗原递呈而诱导产生[12]。尽管这些免疫抑制对维持肝脏内环境的稳态至关重要，但这也可能造成HCC的免疫逃逸。

三、原发性肝癌的免疫概况

肝脏恶性肿瘤通常在慢性坏死性炎症的情况下发生，其特征是细胞死亡，代偿性再生，肝星状细胞(HSCs)过度活化和纤维化，以及侵润的炎症细胞和淋巴细胞的功能改变。在HCC患者中检测到与全身炎症反应相关的自发性肿瘤消退，表明肝癌至少有一些基础免疫原性[13]。另外，据估计，超过一半的HCC患者对肿瘤相关抗原NY-ESO-1自发地产生免疫反应。经皮酒精注射疗法针和射频消融(radiofrequency ablation ，RFA)能诱发T细胞对肿瘤组织的侵润[14]。

在人的肝癌样本中，耗竭性CD8+T细胞和Treg细胞增多，且存在克隆扩增[15]。还检测到了一系列已知的和特征不明显的耗竭相关基因。膜蛋白Layilin在活化的CD8+T细胞和Treg细胞中上调，体外实验发现其可以抑制原始CD8+T细胞产生干扰素γ，该现象与不良预后相关。对泰国的HCC/ICC患者进行大范围基因表达谱检测，发现在癌和癌旁组织之间发现免疫抑制基因，包括PD-L1、PD-1、CTLA-4、TIM3、B7H3和LAG3[16]。

在小鼠模型中，由β-连环蛋白CTNNB1突变导致的肝脏肿瘤对抗PD-1治疗反应率低[17]。可能的机制是，Wnt/β-catenin通路的异常激活导致趋化因子，特别是CCF5的表达受损，引起募集树突状细胞和CD8+T细胞进入肝脏受损。这些受损/缺陷引发HCC的免疫逃逸及对PD-1抗体的反应应答低下，这与在人类HCC中观察到β-连环蛋白活化和抗PD-1治疗抵抗的现象相一致。

四、肝脏肿瘤由“冷”变“热”

尽管ICIs在许多癌症中取得了显著的效果，但发现在相当一部分癌症患者中ICIs治疗是没有效果或仅部分有效，而且出现新的问题，即部分患者对药物产生耐受-最初有效果的患者出现肿瘤的复发。因此，如何提高免疫治疗的有效性，即把“冷”肿瘤变为“热”肿瘤使之对药物有反应，成为一个急迫的问题。(注：根据肿瘤细胞周围的免疫细胞的多少，将肿瘤分为热肿瘤和冷肿瘤。)

一般情况下，HCC对ICIs反应弱。在HCC小鼠模型中，单独注射抗PD-L1抗体，没有显示出任何显著的肿瘤抑制作用[18]。另一项在转基因小鼠系的研究中也获得了类似的结果[17]。因此，如何将冷肝细胞癌转变成热肝细胞癌是非常必要。Lee[19]意外地在小鼠中发现了聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyIC)能够有效地抑制肿瘤。polyIC是一种合成的双链RNA，能有效地激活模式识别受体TLR3、RIG-I/MDA5和蛋白激酶PKR。通过刺激多种天然免疫细胞群，包括肝脏中的NK细胞、M1巨噬细胞和树突状细胞，协同激活这些天然抗肿瘤功能导致在癌前阶段清除“高危”转化细胞，从而防止肝癌的发生[19]。

与polyIC或PD-l1ab单独使用相比，联合使用polyIC和PD-l1ab对肝癌具有明显的抑制作用，甚至对小鼠的晚期肿瘤也有显著的抑制作用[18]。联合治疗后，发现大量的CD8+T细胞被募集并浸润到肝脏肿瘤。值得一提的是，polyIC诱导PD-L1在LSECs中表达与与肿瘤发生无关，因为不论在健康肝脏还是荷瘤的肝脏中都能检测上述现象。因此，这种方法与肝癌肿瘤导致的各种肿瘤免疫逃逸机制无关。总之，这些小鼠的临床前数据证明了用ICIs治疗肝脏肿瘤是一种可行策略。

四、展望

毫无疑问，靶向ICIs的免疫治疗已经改变了肿瘤治疗策略。在治疗不可切除的HCC(IMbrave 150)时，atezolizumab单抗(抗PD-L1)和bevacizumab单抗(抗VEGF)的联合治疗比sorafenib索拉非尼有更好的总生存率和无进展生存率[20]。作为第一个在提高生存率上超过索拉非尼的肝癌治疗策略，这项研究为联合免疫治疗提供了巨大的希望。

对HCC免疫治疗进行有效设计时，必须解决两个关键问题：肝脏肿瘤细胞免疫原性的强度和促进肝癌进展的免疫逃避的具体机制。还有两个问题值得关注，根据可靠的生物标志物筛选出患者可以提高治疗的应答率，另一个更有意思的问题是使用额外的药物将低应答或无应答的患者转化为ICI应答者。总之，通过将临床前研究与临床研究相结合，将有助于发现新的免疫抑制分子和信号通路，为肝癌的靶向治疗提供新的靶点。