尿源性干细胞神经生物学特性及神经修复的研究进展

王姣 李岚 余昌胤△

(1.首钢水钢总医院脑科中心，贵州 六盘水 55300；2.遵义医科大学附属医院神经内科，贵州 遵义 563003)

1 hUSCs的神经生物学特性

1.1hUSCs的来源及特征 尿液获取hUSCs具备非侵入性、无限性，多项研究发现尿液中可提取出USCs，但实验中各方面原因导致所获得的USCs计数约有差异。有研究发现人体24 h内泌尿系统中大约有6×104个细胞的更替[1]。Bharadwaj等[2]从上尿路尿液标本中获得的USC，发现每个USCs克隆30 d内在第5代(P5)时产生约4×108个细胞，其实验数据显示上尿路的尿液1 mL尿含有约1.4+0.7个USCs克隆。Lang等[1]通过对保存24 h的尿液标本所获得的USCs与新鲜尿液标本所获USCs进行比较研究，发现在每100 ml尿液样本中，保存24 h的尿液中有3～4个USCs克隆、12 h的尿液中有4～5个克隆、新鲜尿液中有6～7个克隆。实验中Lang等人从新鲜和24 h保存的尿液标本(保存在含有0.5%血清和10%血清的USC培养基中)收集了30个USC克隆(每组10个)进行端粒酶活性检测，发现半数(5/10)保存细胞克隆具有较高的端粒酶活性，而(4/10)新鲜USCs具有端粒酶活性，均为正常核型。也有研究表明[3]，75%以上的中老年个体端粒酶活性(USC-TA+)表达，并保留长端粒长度，但在50岁或50岁以上的hUSCs的USCs-TA+下降到50%～60%。近年来，随着基于干细胞研究的快速发展，干细胞的多项分化特性，目前多项研究[4-6]证实在特定的培养基中可培养出连续传代且核型稳定的hUSCs，并在融合率80%左右的第4代hUSCs分别加入成脂、成骨、成神经诱导培养液后，诱导12 d、14 d、21 d后经染色鉴定后可证实hUSCs可成功分化为成脂细胞、成骨细胞、神经细胞。

1.2hUSCs的神经分化条件 2008年张元原教授[7]首次成功地分离培养出三种不同形态的表现为完全分化、分化、祖细胞样细胞的细胞，证实了只有纺锤体外观的小细胞类型被命名为人尿源性干细胞(hUSCs)，将提取出的hUSCs通过流式细胞术检测其表面标志物(SSEA 4、CD 105、CD 73、CD 90和CD 44)呈阳性，说明hUSCs具有间充质干细胞相似特性。hUSCs一旦被分离后，可在体外连续扩增，并在不同的实验条件下加入不同的生长因子和细胞外基质(ECM)后通过特异性诱导分化为多种细胞类型，通过在补充碱性成纤维细胞生长因子的神经诱导培养基中培养USCs，获得神经元细胞[8]。研究表明层粘连蛋白和PDGF-bb参与神经元的生长和分化[9]，神经元祖细胞在PDGF-BB刺激后，可使miR-9(microRNA-9)表达增加，而PDGF-bb介导的mir-9/MCPIP1通过抑制miR-9靶点MCPIP1(monocyte chemotactic protein-induced protein 1 )调节神经祖细胞的增殖、分化和迁移[10]，表明调节miR-9/mcp 1轴的治疗策略的制定可以被认为是一个涉及促使神经发生受损的各种神经退行性疾病的治疗潜在的靶点。故Kim JY[9]等将hUSCs在神经元分化培养基中分别及共同加入层粘连蛋白和PDGF-bb诱导神经元分化，培养14 d后，hUSCs表现为神经元样形态改变，包括锥体细胞体、轴突样结构和树突，在上述所有3种诱导条件下均能观察到神经元样细胞，其中神经元分化培养基(DM)+层粘连蛋白+PDGF-bb处理组神经元细胞最多。提示层粘连蛋白和PDGF-bb可刺激hUSCs向神经元细胞分化。Chun等[10]研究指出hUSCs体外培养时在I型胶原和缺氧条件下可刺激细胞增殖，保留干细胞特性，但分化受到抑制。

1.3hUSCs自身表达神经细胞特异性蛋白 Jung Yeon Kim等[9]应用实时PCR分析及流式细胞术检测证实hUSCs可表达神经元标记蛋白巣蛋白(Neuroepithelial stem cell protein，Nestin)、微管相关蛋白2(Microtubule-associated protein 2，MAP-2)、微管蛋白β(β-Tubulin-Ⅲ)、神经丝蛋白(Neurofilamentprotein，NF-M)和神经元特异性核蛋白(Neuron specific nuclear protein，NeuN)，并用免疫细胞化学染色检测到hUSCs表达Nestin、MAP-2、β-Tubulin-Ⅲ和NF-M等神经元标记蛋白。而且，在神经诱导培养基诱导后检测到SOX2和Nestin阳性细胞数显著增加，且在RT-PCR基因表达分析表明，神经元祖细胞标记Nestin和SOX2显著增加[5-6]，而成熟神经元标记β-Tubulin-Ⅲ未被上调[5]，提示hUSCs可分化为神经祖细胞。约40%的诱导细胞表达多种神经标记物，如Nestin、S100、NF 200和GFAP，在体外和体内均表现出神经源性的延伸和突起[5]。龚飞翔[6]通过q-PCR检测比较hUSCs经神经诱导培养7 d和12 d后的神经标志物的表达量，发现12 d后SOX2(神经祖细胞标志物)和GFAP(神经胶质细胞标志物)的表达上调，而NSE和MAP-2(成熟神经元标志物)的表达下调，同时，细胞免疫荧光检测结果显示hUSCs经神经诱导前未见明显Nestin和SOX2阳性细胞，诱导后7 d和12 d其表达量明显增加，且在12 d时仍在继续增加。上述研究均提示hUSCs具有分化为与神经元相似的神经生物学特性。

1.4hUSCs神经营养作用 多项体内外研究发现，各种细胞生长因子及神经营养因子在神经细胞存活、增殖及分化调节中具有至关重要的作用，这些生长因子主要包括：表皮生长因子家族(Epidermal growth factor，EGF)、成纤维细胞生长因子家族(Fibroblast growth factor，FGF)、胰岛素样生长因子(Leucocyte inhibitory factor，IGF)、脑源神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)，胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)等；这些细胞因子可诱导干细胞向神经元定向分化。碱性成纤维生长因子( Basic fibrolast growth factor, bFGF) 是广泛存在于干细胞中的一种多肽物质，是酪氨酸激酶的胞外配体，具有传递发育信号和修复组织的作用，同时可调控神经细胞增殖分化过程，Perez-Ilzarb等[11]通过探讨比较人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外扩增培养条件时发现高浓度的bFGF可明显促进hMSCs增殖，而低浓度bFGF则可诱导hMSCs向神经细胞的定向分化。故实验中在无血清诱导培养基中加入bFGF、EGF可有效地使hUSCs稳定增殖且不影响神经元标志物的表达。hUSCs在良好的微环境下可分泌细胞因子，最近，有研究发现生长因子(VEGF、IGF-1、FGF-1、PDGF、HGF和NGF)从海藻酸钠微球中局部释放出来[12]，诱导hUSCs的功能分化，增强血管再生及神经支配，并刺激体内驻留细胞的生长。表明hUSCs与其他干细胞一样具有神经营养作用。

1.5hUSCs外泌体 外泌体(Exo)属于细胞外囊泡(EV)的一种，是由细胞膜内陷形成胞内小泡，小泡膜经过胞浆内各种酶类的修饰、转运、融合，最后通过胞吐的方式排到胞外。外泌体包含有mRNA、miRNA及蛋白质等多种小分子的小囊泡。几乎所有细胞均可产生外泌体，有研究证实[13]Exo还包含有HGF、BDNF、VEGF、ICF、NGF，且ICF、HGF含量较高，推测这两钟细胞因子可能对神经损伤有保护作用，并且其保护作用可能是通过凝脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路实现的。Jiang等[14]通过超滤组合纯化方法分离来自尿源干细胞条件培养基中的外泌体(USCs-Exo)，并在透射电子显微镜(TEM)下可以看到USCs-Exo是约100 nm的球形囊泡，可调电阻脉冲传感(TRPS)分析显示USCs-Exo的大小约为50-100 nm，与TEM一致。Western印迹显示USCs-Exo中表达CD9，CD63和CD81等外泌体标记物，该研究进一步进行酶联免疫吸附试验(ELISA)证实了USCs-Exo含有促进血管生成及细胞存活的细胞因子包括足细胞存活因子(BMP-7)和血管生成相关蛋白(VEGF，TGF-β1和血管生成素)。上述研究提示外泌体可能是神经保护作用或治疗中的关键组件。

2 hUSCs对中枢神经系统损伤的应用

hUSCs是近年来发现的新型干细胞，有研究证实hUSCs在替换衰老、受损细胞方面以及促进器官组织再生方面均发挥着重要作用。而且以前有研究证实MSCs免疫原标记HLA-DR(II类MHC)在极少(<3%)的细胞中表达，说明免疫排斥反应较低[15]，且应用免疫细胞化学检测未发现HLA-DR(II类MHC)表达增强[16]。hUSC与MSCs具有相似特性，其移植后也可能无排斥而具有良好的安全性，提示hUSC可作为细胞移植治疗的潜在细胞。

Guan等[5]首次探讨hUSC应用于神经元再生的治疗，实验通过与ASCs比较，证明hUSC与ASCs具有相识的生物学特性，可在体外分化为神经细胞，该实验进一步用绿色荧光蛋白(GFP)转染第4代USCs，然后将GFP标记的hUSC(GFP-hUSC阳性细胞)种植在BeaverNano水凝胶支架上，在脑损伤后的8周龄SD大鼠病变部位注射含有1×106GFP-hUSC的100ml水凝胶，移植3周后，可见GFP阳性细胞聚集在病灶周围区域，而在海马区也发现GFP阳性细胞，通过检测发现移植的GFP阳性细胞也能表达β-Tubulin-Ⅲ、GFAP和Nestin等神经分化标记物，说明hUSC大鼠脑内具有生存、迁移及神经分化能力。龚飞翔[6]将hUSCs通过慢病毒转染标记GFP后移植到脑损伤模型大鼠脑内，发现移植1W、3W后均可见GFP-hUSCs阳性细胞从脑损伤区迁移至海马区，并且在海马区分别在移植1W后检测到Nestin阳性细胞及移植3W后检测到β-Tubulin-Ⅲ、GFAP阳性细胞，证实了hUSCs脑内移植后的存活、迁移以及分化能力，表明hUSC是具有中枢神经系统损伤后功能修复的潜在细胞。

3 展 望

hUSCs是近年来发现的从尿液中分离提取的一种新型干细胞。目前，研究发现在实验性脑卒中模型中移植骨髓间充质干细胞(MSC)可减少神经元损伤和梗塞体积，增加血管生成和神经发生，改善神经功能。由于其在临床前模型中的有益作用，已开始使用MSCs进行对照随机临床试验以治疗脑卒中，最长观察5年没有发现临床相关的副作用[17]。由于干细胞及祖细胞均能分泌因子(外泌体)促进脑缺血后神经功能的恢复，DOEPPNER团队[18]将MSC-EV和MSC移植到短暂局灶性脑缺血模型小鼠，研究结果显示，MSC-EV与MSC均能有效地改善神经损伤，并诱导与增强的血管神经发生相关的长期神经保护作用，且两者效果相似，因此他们认为EV是MSCs促进卒中后恢复的关键组成部分。hUSCs无侵入性、易获取，具有干细胞的生物学特性，目前仅有为数不多的研究将hUSCs用于中枢神经系统损伤，但在脑缺血、神经系统变性及退行性疾病等相关研究值得进一步深入探讨。