四妙勇安汤通过JAK/STAT信号通路治疗下肢动脉硬化闭塞症的机制研究

王继雪，杨稀瑞，吕勃川，张百亮，赵 钢

（1.黑龙江中医药大学，2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨150040）

下肢动脉硬化闭塞症（arteriosclerosis obliterans，ASO）是一种下肢缺血性疾病，主要为下肢动脉发生粥样硬化性的病理改变，导致动脉逐渐狭窄、闭塞［1］。由于闭塞的管腔无法向患侧肢体供应血液，可引起间歇性跛行、患侧肢体疼痛，严重者甚至可引起溃疡、坏死等［2］。据统计，75岁以上人群中ASO 的发病率高达15%～20%，普通人群发病率为3%～10%，以老年男性患者居多，给患者带来极大痛苦的同时也给家庭及社会带来巨大负担［3］。越来越多的研究证实，炎性反应贯穿ASO 的全过程并在其中扮演重要角色，血管平滑肌细胞的过度增殖是促进动脉粥样硬化斑块形成，加剧动脉粥样硬化进程的主要因素［4］。

本病属于中医“脱疽”范畴，早在华佗《神医秘传》中记载……“内服药用金银花三两，元参三两，当归二两，甘草一两，水煎服”。清·鲍相敖《验方新编》中将本方命名为四妙勇安汤，此即后世治疗脱疽养阴活血通络之名方，并在临床上均取得了较好的疗效［5-7］。现有的实验研究多基于单通路或单靶点对四妙勇安汤治疗ASO 的机制进行了研究，然而未能充分体现中药及复方多成分、多靶点、多通路的作用特点［8-10］。因此，本研究基于网络药理学方法对四妙勇安汤治疗ASO 的潜在机制进行生物信息学预测，并以细胞实验进行验证，为今后中医药在治疗ASO的实验研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 四妙勇安汤主要活性成分筛选

通过TCMSP 数据库，依次以“当归”、“金银花”、“玄参”、“甘草”作为检索词，筛选四妙勇安汤所含中药的活性成分。以化合物活性成分OB≥30%及DL≥0.18作为筛选条件，收集各中药有效活性成分靶点。

1.2 药−病靶点网络的构建

通过GeneCards、OMIM 数据库以“Arteriosclero⁃sis occlusion”作为检索词，分别下载与ASO 相关靶点。并将1.1中所得到的药物靶点与ASO靶点进行交互处理，即药-病靶点，并药-病靶点通过Cytoscape 软件进行网络药理学可视化分析。

1.3 蛋白互作网络的构建

将药-病靶点上传至String 数据平台进行蛋白互作（protein protein interactio，PPI）网络。以“Homo sa⁃piens”进行限定，互动得分为0.400。基于Cytoscape软件对PPI网络进行网络药理学可视化分析。

1.4 GO和KEGG富集分析

将药-病靶点输入于DAVID 功能分析数据平台，进行基因本体论（gene ontology，GO）分析及京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，以“Homo sapiens”作为限定。通过OmicShare 及Cytoscape 软件对GO 及KEGG功能富集分析进行网络药理学可视化分析。

1.5 动物及细胞

24只SPF级健康SD 大鼠，体质量180～220 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）：2016-0006。各组大鼠均采取单独饲养，自由饮食水。大鼠血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）购自中国科学院典型细胞培养物保藏委员会细胞库。实验过程严格按照动物伦理及福利相关要求进行。

1.6 药品及试剂

四妙勇安汤（组成：金银花、玄参各50 g、当归30 g、生甘草50 g），由黑龙江中医药大学附属第一医院药剂科提供，蒸馏水浸泡60 min，文火反复煎煮2 次，取汁备用，并以纱布反复滤过2次，以80℃水浴制备含量为每1 mL 含生药1 g 的混悬液药汁，以无菌玻璃瓶密封，4℃冰箱备用储存。阿托伐他汀片（20 mg/片，国药准字：J20120050）购于辉瑞制药有限公司；ox-LDL 购自广州奕元生物生物技术有限公司；IL-1β、IL-6 试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BrdU、CCK8 试剂盒、GAPDH 兔抗鼠单克隆抗体Triton X-100、First Strand cDNA Synthesis Kit、Real Time PCR Kit、购自上海碧云天生物科技有限公司。PBS 磷酸盐缓冲液购自美国Sunbio公司。

1.7 含物血清制备

健康SD 大鼠24 只，随机分为4 组，每组6 只。按正常成人用药剂量，根据人和大鼠体表面积折算等效剂量［11］，高剂量组给予中药汤剂4 g⋅kg-1⋅d-1灌胃，中剂量组给予中药汤剂3 g⋅kg-1⋅d-1，低剂量组给予中药汤剂2 g⋅kg-1⋅d-1灌胃，1.5 mL/次，每日1次灌胃。空白组予等量生理盐水，阿托伐他汀对照组予以3 μmol/L进行干预。连续灌胃7 d，末次灌胃2 h后，予1%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，无菌条件下于腹主动脉采血，静置4 h，以3 000 r/min，4℃下进行15 min 离心，分离血清，0.22 μm 滤膜过滤，56℃水浴灭菌，30 min 灭活，−20℃情况下备用。

1.8 细胞培养及实验分组

VSMCs 用DMEM 培养基于5% CO2、37℃恒温培养箱中进行培养。并取对数期生长的细胞以6×104/孔接种于100 mm 培养皿中，将纯化培养48 h 的VSMCs随机分为6组，分为空白组，模型组，低、中、高剂量中药血清干预组和阿托伐他汀干预组。空白培养组用稀释后的不含药的大鼠血清继续培养48 h。模型组，低、中、高剂量中药血清干预组和阿托伐他汀干预组经ox-LDL作用24 h后，分别加入使用VSMCs维持培养液稀释10倍的不含药的大鼠血清，低、中、高剂量中药血清和阿托伐他汀母液培养24 h。各组均设置6个孔，置于37℃、5 % CO2培养箱中培养24 h 后用于检测。

1.9 检测指标

1.9.1 倒置显微镜观察各组细胞形态 取生长稳定浓度为1×106个/mL 的VSMCs 0.5 mL，PBS 缓冲液漂洗两遍，加入1～1.5 mL的消化液消化、离心后接种于培养皿，分为空白组、模型组、四妙勇安低、中、高剂量组、西药组，于37℃、5%CO2条件下的培养箱进行同化处理，依次加入15% 0.15 mL 的含药血清和1×10-6mol/L 的阿托伐他汀，继续培养4～6 h 后，于倒置显微镜下观察比较细胞形态变化。

1.9.2 CCK8 及BrdU 法实验检测VSMCs 增殖水平 采用CCK8试剂盒，于接种后的第24、48、72 小时分别检测各组VSMCs 的增殖，参照CCK8 试剂盒说明进行操作，ELISA 检测仪测定各孔450 nm 处OD数值。

将VSMCs接种于6孔板中，每孔1.5×105个，待细胞贴壁后行同步化处理。各组细胞干预48 h后，于各孔内加入BrdU 液20 μL，置于培养箱中孵育4 h，室温下加4 %多聚甲醛固定15 min，并予0.1% Triton X-100进行洗涤，5%脱脂奶粉封闭1 h，加BrdU 抗体，置于4 ℃下孵育过夜，红色荧光标记羊抗鼠二抗，室温下孵育1 h，予甘油封片，荧光显微镜下观察各组BrdU阳性细胞数。

1.9.3 ELISA 法 检 测IL⁃6、IL⁃1β 表 达 水 平 取VSMCs加入缓冲液，3 000 r/min，离心10 min，提取上清，并按IL-1β、IL-6 ELISA 试剂盒说明书方法，对浓度已达到均衡的VSMCs 中IL-1β、IL-6 的含量进行检测。

1.9.4 RT⁃PCR 检测PCNA、JAK2、STAT3 mRNA表达水平 采用TRlzol 法提取总RNA，采用核酸检测仪检测其浓度，并于各样本中取1 μg 的RNA，分别加入M-MLV 缓冲液4 μL、M-MLV 1 μL、RNasin 0.5 μL、DNTP 2 μL，无RNA 酶水至20 μL，通过逆转录反应合成cDNA。基于2-∆∆Ct法计算mRNA 表达水平。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR 中的PCR 反应引物Tab 1 PCR reaction primers in RT Qpcr

1.10 统计学处理

所有实验数据均采用SPSS 23.0 软件进行分析。其中，计量资料以（±s）表示，组间数据比较采用单因素方差分析检验，两两比较采用最小显著性差异检验。以P＜0.05 代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四妙勇安汤活性成分筛选结果

共检索得到四妙勇安汤所有活性成分126 个，根据OB 值将各药物排名前5 的有效活性成分基本信息见表2。

表2 四妙勇安汤活性成分Tab 2 Active ingredients of Simiao Yong'an decoction

2.2 药-病网络的构建及可视化分析

将所得到的194 个药物靶点与617 个疾病靶点进行交互处理，总共获得40 个药-病靶点，见图1A；并通过Cytoscape 软件对药-病靶点进行网络药理学可视化网络分析，见图1B。

2.3 蛋白互作网络的构建及网络可视化分析

图1 药物⁃疾病⁃靶点网络Fig 1 Drug⁃disease⁃target network

将40 个药-病靶点通过String 数据平台进行PPI 网 络 分 析，通 过Cytoscape 软 件 对PPI 结 果 进 行网络可视化分析。本网络共有95 个节点，328 条边。按照节点Degree 值将40 个靶点进行升序排列，排名较前的靶点依次为IL-6、IL-1β、MMP-9、VEGFA、MMP-2 等，见图1C。

2.4 GO 功能富集分析结果

基于DAVID 功能分析数据平台对40 个药-病靶点进行GO 功能富集分析，共获得99 条GO 功能注释结果。根据P 值及富集靶点数目，对GO 功能分析所包含的BP、MF 及CC 富集结果进行升序排列，见图2、表3。

图2 药物⁃疾病⁃靶点GO 功能分析柱状图Fig 2 Histogram of drug⁃disease⁃target go function analysis

表3 药物⁃疾病GO 功能分析结果Tab 3 Results of drug⁃disease go function analysis

2.5 KEGG 通路富集分析结果

通过DAVID 功能分析数据平台对40 个药-病靶点进行KEGG 通路富集分析，共得到48 条富集信号通路，富集排名靠前的通路主要有JAK-STAT、HIF-1、Toll-like receptor 等信号通路，详见通过Cy⁃toscape 软件对药-病靶点与富集通路进行网络药理学可视化分析，见图3、表4。

2.6 各组细胞整体形态比较

空白组VSMCs 为贴壁生长细胞，平铺于培养皿底部，呈现多角形、梭形或不规则形状，细胞质均匀、大小均等；模型组VSMCs 损伤后细胞形态紊乱、生长速度缓慢；四妙勇安不同剂量组干预后，细胞形态饱满，成卵圆或梭形分布，较模型组及阿托伐他汀组生长迅速，疏密分布均匀；阿托伐他汀组细胞细胞形态较为规则，成梭形分布，较模型组生长速度快，见图4。

图3 药物⁃疾病⁃靶点KEGG 富集分析结果Fig 3 Drug⁃disease⁃target KEGG enrichment analysis results

表4 药物-疾病KEGG 富集分析结果Tab 4 Drug-disease KEGG enrichment analysis results

2.7 四妙勇安汤对VSMCs 增殖的影响

CCK8 检测结果显示，与空白组OD 值相比，模型组24、48 h 和72 h 的OD 值明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组OD 值相比，四妙勇安各剂量组及对照组24、48 h 和72 h 的OD 值明显降低（P＜0.05），见表5。

BrdU 检测结果显示：与空白组比较，模型组Br⁃dU 阳性细胞百分比显著促进VSMCs 增殖（P＜0.05）；与模型组比较，四妙勇安汤各剂量组BrdU 阳性细胞百分比能明显抑制VSMCs 增殖（P＜0.05）；四妙勇安汤高剂量组BrdU 阳性细胞百分比优于阳性对照组（P＞0.05），见图5、表5。

图4 各组细胞形态学结果比较Fig 4 Comparison of morphological results of each group

表5 各组VSMCs 增殖水平的比较（±s）Tab 5 Comparison of VSMCs proliferation in each group（±s）

表5 各组VSMCs 增殖水平的比较（±s）Tab 5 Comparison of VSMCs proliferation in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别空白组模型组四妙勇安汤低剂量组四妙勇安汤中剂量组四妙勇安汤高剂量组对照组阳性细胞（%）7.65±2.43 74.68±8.91*41.23±4.67#27.45±3.24#12.13±2.56#14.62±1.45 90.773＜0.001 FP 24 h（OD）0.52±0.12 0.89±0.09*0.81±0.11#0.71±0.14#0.57±0.07#0.59±0.05 6.293 0.004 48 h（OD）0.69±0.09 1.35±0.12*0.89±0.11#0.82±0.05#0.89±0.08#0.93±0.06 19.054＜0.001 72 h（OD）0.81±0.11 1.48±0.12*0.94±0.04#0.97±0.13#1.21±0.16#1.27±0.11 13.535＜0.001

图5 各组细胞BrdU 增殖结果比较Fig 5 Comparison of BrdU proliferation results in each group

2.8 四 妙 勇 安 汤 对VSMCs 中IL-6、IL-1β 表 达水平的影响

ELSIA 检测结果显示：与空白组比较，模型组VSMCs 中IL-1β、IL-6 水 平 明 显 上 升，（P＜0.05）。与模型组比较，四妙勇安汤各剂量组中IL-1β、IL-6 水 平 均 呈 现 下 降 趋 势（P ＜0.05），表明四妙勇安汤可改善因ox-LDL 所诱导的ASO所造成的炎症反应，且呈剂量依赖性，见表6。

2.9 四妙勇安汤对VSMCs 中PCNA、JAK2 和STAT3 mRNA 表达水平的影响

RT-PCR 检测结果显示：与空白组相比，模型组PCNA mRNA 表达水平显著上调；与模型组相比，四妙勇安各剂量组的PCNA mRNA 表达呈剂量依赖性下调，差异具有统计学意义（P＜0.05），四妙勇安高剂量组与阳性对照组相比，PCNA mRNA 表达水平下调，差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组相比，模型组JAK2、STAT3 mRNA 表达水平显著上调；与模型组相比，四妙勇安各剂量组JAK2、STAT3 mRNA 表达呈剂量依赖性下调，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表7。

表6 各组细胞中IL⁃6、IL⁃1β 水平的比较（±s）Tab 6 Comparison of IL⁃6 and IL⁃1 β levels in each group（±s）

表6 各组细胞中IL⁃6、IL⁃1β 水平的比较（±s）Tab 6 Comparison of IL⁃6 and IL⁃1 β levels in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别空白组模型组四妙勇安汤低剂量组四妙勇安汤中剂量组四妙勇安汤高剂量组对照组IL⁃1β（pg/L）0.29±0.08 0.54±0.12*0.36±0.07#0.34±0.09#0.27±0.06#0.31±0.13 3.175 0.047 FP IL⁃6（pg/L）7.94±0.98 11.32±1.12*9.57±1.27#7.68±1.09#7.12±0.87#7.35±0.68 7.685 0.002

表7 各组细胞中PCNA mRNA 表达比较（±s）Table 7 Comparison of PCNA mRNA expression in each group（±s）

表7 各组细胞中PCNA mRNA 表达比较（±s）Table 7 Comparison of PCNA mRNA expression in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

空白组模型组四妙勇安汤低剂量组四妙勇安汤中剂量组四妙勇安汤高剂量组对照组STAT3/GAPDH 1.00±0.01 2.16±0.57*1.54±0.29#1.19±0.08#1.04±0.13#1.14±0.11 7.94 0.002组别FP PCNA/GAPDH 1.00±0.01 2.61±0.54*1.92±0.32#1.67±0.16#1.15±0.09#1.34±0.12 14.297＜0.001 JAK2/GAP⁃DH 1.00±0.01 1.96±0.19*1.49±0.14#1.24±0.12#1.09±0.09#1.13±0.11 25.339＜0.001

3 讨论

下肢动脉硬化闭塞症的病理因素复杂，主要包括痰浊瘀血致肢端脉道不利、气血不能伸达四末、濡润失职、故出现皮槁肉枯，甚则骨节缺血坏死，病机主要为脉络瘀阻。四妙勇安汤作为治疗脱疽的经典方剂，药效复杂，可通过多靶点、多通路共同发挥治疗ASO 的作用。若通过实验逐一明确其作用机制比较困难，故本研究通过网络药理学筛选四妙勇安汤治疗ASO 的活性成分，获取作用靶点，构建成分-靶点网络，进行GO 功能分析及KEGG 富集分析。结果表明与治疗ASO 相关度较高的化合成分126 种，作用靶点40 个，涉及信号通路48 条。本研究通过蛋白互作网络（PPI）分析发现药-病相关密切的 靶 点IL-6、IL-1β、MMP-9 等，其 中IL-6、IL-1β等与炎症反应相关的通路有关［11-13］。实验研究证实，IL-6 在炎症反应的调节中至关重要，是炎性反应的重要介质，而炎症反应则是近年倍受关注的一种周围血管性疾病的诱导因素之一，IL-6 作为急性期细胞因子，通过释放大量白细胞聚集，达到刺激局部炎症的作用，增加动脉斑块的不 稳定性［14］。ASO 发病过程中，IL-1β 的过表达导致脂质代谢紊乱、促进内皮细胞表达及提 高 促 炎 分 子IL-1、IL-6 表 达 水 平［15］。已 有 研究证实，四妙勇安汤可以通过抑制炎症细胞信号通路的相关蛋白起到防治动脉硬化形成的作用［16，17］。这与本研究的网络药理学结果是相似的。

PCNA 作为与细胞增殖相关的DNA 合成蛋白，是公认的细胞增殖标记物，其表达上调或下调提示细胞增殖水平的上升或下降，PCNA 含量与DNA 合成一致，是G1～S 期细胞调控蛋白，对调控细胞增殖起到关键作用［18-20］。因此，通过观察PCNA 蛋白的含量的变化，能够很好地反映出VSMCs 的增殖情况。JAK/STAT 通路是近年来才被发现的由细胞因子刺激的信号转导通路，主要参与细胞增殖、分化、凋亡，且对免疫调节等诸多生物学过程起到关键调节作用［21］。该信号通路主要由上游JAK 蛋白家族、下游转录因子STAT 家族及酪氨酸激酶相关受体组成。各细胞因子与受体结合，加速受体二聚体化进程，被活化的STAT3 蛋白以二聚体形式与核内靶基因结合，参与基因转录，引发受体偶联的JAK 激酶靠近，激活所交互的酪氨酸发生磷酸化［22］。ASO 作为一种慢性炎症反应过程，涉及包括VSMCs 和炎症细胞在内的多种细胞的参与，在炎症反应过程中，VSMCs 由静止收缩转为分泌增殖，产生大量细胞及生长因子，其增殖及迁移同样是引起动脉内膜增殖及血管管腔狭窄的关键因素；相关研究发现，中医药对JAK/STAT 信号通路具有一定干预作用，中医药可通过抑制活化后的JAK2/STAT3 信号通路，发挥抗炎和抑制VSMCs 的增殖及凋亡［23-25］。 由 此 可 见，JAK/STAT 通 路 贯 穿 于ASO 的 全 过 程，加 速ASO 的 发 生 与 发 展［26，27］。

本研究以四妙勇安汤进行预治疗ox-LDL 所诱导的VSMCs 模型，并以CCK-8 法及BrdU 法观 察VSMCs 增 殖 情 况，ELISA 法 检 测IL-6、IL-1β 水 平，RT-PCR 法 检 测 PCNA、JAK2 及STAT3 mRNA 表达水平，探讨四妙勇安汤在抑制VSMCs 增殖方面的作用机制。结果显示，随着时间推移，四妙勇安各剂量组能够显著抑制VSMCs 增殖（P＜0.05）；与空白组相比，模型组BrdU 阳性细胞百分比显著促进VSMCs 增殖（P＜0.05）；与模型组比较，四妙勇安汤各剂量组BrdU 阳性细胞百分比能明显抑制VSMCs 的增殖（P＜0.05）；此外，四妙勇安汤能够抑制PC⁃NA、JAK2、STAT3 mRNA 表达（P＜0.05）；在此基础上，本研究继续采用RT-PCR 法观察VSMCs 中PCNA、JAK2 及STAT3 mRNA 表 达水平，发现四妙勇安汤能够显著抑制VSMCs 中PCNA、JAK2 及STAT3 mRNA 表达（P＜0.05）。

综上所述，四妙勇安汤能够通过抑制IL-6及IL-1β 水 平，下 调VSMCs 中PCNA 及JAK2、STAT3 mRNA 表达水平，调控VSMCs 的增殖，达到抑制ASO 的作用。