基于网络药理学探讨益肾健脾核心药对治疗少弱精症的作用机制

于旭东，商建伟，邓 省，王继升，刘蕊嘉，司红梅，刘晓訸，张耀圣

（北京中医药大学东直门医院，北京100700）

夫妻备孕1 年以上，且性生活规律，由于丈夫的因素而使妻子不能自然受孕，定义为男性不 育 症（male infertility）［1］。排 除 妻 子 因 素 后，连续2 次对男性患者进行精液常规检查，两次检查结果提示精子密度均小于20×106/mL，前向运动的a 级精子以及b 级精子之和即a 级+b级＜50% 或a 级精子＜25% 即诊断为少弱精症（oligospermia and asthenospermia）［2］。随 着 社 会经济的发展，中青年一代社会压力与日俱增，以及生活方式的改变，罹患男性不育症的患者也越来越多。据不完全统计，目前在全球不孕不育的罹患率已经提升到15%～18%，其中男性原因所占比例高达50%，而在这之中精子质量 低 下 是 主 要 诱 因［3，4］。在 我 国，已 有 研 究 表明1995～2008 年间精子浓度以1.40%～2.15% 的速度逐年递减［5］。并且，随着二胎政策的开放，“高龄父亲”不断涌现，对于男性少弱精症的治疗面临越来越大的挑战。现代医学暂无治疗男性生精障碍的特效药物，现有的手术及药物治疗，虽然有一定疗效，但适应面较窄。辅助生殖技术虽然很大程度上解决了生育困难的问题，但是也存在包括活产率不高、花费巨大、副作用较多及存在遗传、伦理风险等诸多弊端。因此，深入研究男性生精功能下降的可能机制并寻找更为安全有效的干预手段对于男性少弱精症的治疗具有重大意义。

张耀圣教授在长期的临床实践中发现对于本病的治疗，在传统补肾的基础上加以健脾的药物可以明显提高疗效。因此张教授提出了益肾健脾法治疗少弱精症的新思路，并完成了相关的临床研究，研究结果表明本治疗方法对少弱精症的改善明显优于传统补肾疗法［6］。其中“菟丝子-枸杞子”是益肾组的核心药物，“党参-黄芪”是健脾组的核心药物。由此可见，益肾健脾法的核心药对对于生殖功能有明显的改善效应，但是作为其起效的确切效应有待进一步明确。因此笔者选取张耀圣教授临床上应用的核心药对“菟丝子-枸杞子”和“党参-黄芪”进行网络药理学研究，以期能够初步揭示益肾健脾法治疗少弱精症的分子机制，为中医药在少弱精症中的推广应用提供依据。网络药理学的研究方法通过构建药物与疾病的互作关系网络，并通过GO 和KEGG 富集分析实现预测药物有效成分在疾病效应靶点中的可能作用机制［7，8］。本 研 究 从 中 医 临 床 实 践 出 发，以 中 医基础理论为指导，应用网络药理学的研究方法从探讨益肾健脾法治疗少弱精症的可能机制，本研究旨在为本病的临床实践提供更多的治疗方法，同时为深入的实验研究提供前期基础。

1 材料与方法

1.1 益肾健脾中药的活性成分

应用中药系统药理学分析平台（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检 索 益 肾 健脾法核心药对“枸杞子-菟丝子”、“党参-黄芪”的所有活性成分。根据研究结果，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18 为 限 制 条 件 进 行筛选。

1.2 少弱精症的疾病靶点

设置检索词为“oligospermia and asthenosper⁃mia”，应 用GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）进 行查找。

1.3 药物与疾病共同靶点筛选及互作网络构建

首先将益肾健脾法的两组核心药对靶点进行取并集操作，然后通过R 语言运行脚本方法绘制药物与疾病共同靶点的Venn 图，同时输出药物与疾病的共同靶点文件；然后应用STRING（https：//string-db.org/）平台构建共同靶点PPI，最低相互作用阈值设为“highest confi⁃dence”（＞0.9）。并应用R 语言走脚本的方法统计共同靶点的频次并绘图。所有R 包下载通过R 和 Bioconductor（https：//www. bioconductor.org/）。

1.4 药物-疾病-靶点互作网络构建

应用Cytoscape 3.7.1 软件构益肾健脾核心药物和少弱精症的互作网络。

1.5 GO 分析和KEGG 通路富集分析

应用R 语言对益肾健脾核心药物与少弱精症的共同靶点进行GO 和KEGG 富集分析。

2 结果

2.1 益肾健脾核心药物有效成分筛选

本研究通过TCMSP 数据库检索得到药物的有效成分如下：枸杞子188 个、菟丝子29 个、党参134 个、黄芪87 个，共计512 个有效成分。以口服生物利用度（OB）≥30% 和类药性（DL）≥0.18 为条件对益肾健脾核心药物的有效成分进行限制，最后共筛选出97 个药物的有效成分。

2.2 男性少弱精症的疾病靶点筛选

笔者对“少精症”与“弱精症”进行分别检索并选取并集以避免遗漏，去除重复后得到少弱精症的最终疾病靶点，其中GeneCards 数据库分别得到少精症和弱精症504 和131 个疾病靶点，共计得到635 个靶点。

2.3 益肾健脾核心药物与少弱精症互作网络构建

首先对益肾健脾核心药物与少弱精症的靶点取交集，结果为46 个，得到韦恩图，见图1 及表1；同时构建药物与疾病的共同靶点PPI，见图2。此外，通过运行脚本的方法汇总出现频次前30 的靶点并以条形图的形式体现，见图3。

2.4 药物-疾病-靶点互作网络构建

应用cytoscape3.7.1 软件构建药物-疾病-靶点的网络模型，包括86 个节点（靶点46 个，有效 成 分35 个，疾 病1 个 和 药 物4 个）和271 条边，其中红色OA 指疾病-少弱精症（oligosper⁃mia and asthenospermia），绿 色GQZ、DS、TSZ、HQ 分别代表枸杞子、党参、菟丝子、黄芪四种药物，显示为紫色的是四种药物的有效成分，显示为黄色的是少弱精症的靶点，见图3。

图1 药物与疾病靶点韦恩图Fig 1 Venn diagram of drug and disease targets

表1 药物与疾病共同靶点Tab 1 Common targets of drugs and diseases

图2 共同靶点蛋白出现频次Fig 2 Frequency of common target proteins

图3 药物-疾病-靶点互作网络Fig 3 Drug-disease-target interaction network

2.5 益肾健脾核心药物治疗男性少弱精症核心通路筛选

通过R 软件运行脚本的方法进行GO 和KEGG 通路富集分析，见图4，结果提示主要包括氧化活性、磷酸酶结合、内源性激素调节等生物学过程。表3 中列出了位次靠前的20 个信号通路（排除广泛通路后）。统计后发现46 个共同靶点主要分布于IL6、ESR1、EGFR、AKT等多条信号通路中。其中，节点的大小表示富集到的靶点数目，因此节点越大则表明改信号通路上富集的靶点越多；颜色越接近红色以及红色的色度越深则表明该条通路的P 值越小，显著性就越高［9］。

图4 通路富集（前20 个）Fig 4 pathway enrichment（top 20）

表2 靶点通路富集结果（前20 个）Tab 2 Result of target pathway enrichment（top 20）

3 讨论

益肾健脾中药治疗男性少弱精症主要以补肾药代表“菟丝子、枸杞子”及健脾药代表“党参、黄芪”四味中药组成。有学者整理传统医家文献并分析发现传统医家在治疗本病方面用药以补虚药为主，其中高频次用药与本次研究的两组药对相符［10-12］。因此，我们认为益肾健脾中药通过调控“先、后天”改善精子活力，进而实现治疗少弱精症的作用。益肾健脾法核心药物的有效成分对于生殖功能有明显的改善效应。本研究经初步筛选得到益肾健脾法核心药对的97 个活性成分。在药物-疾病-靶点互作网络中degree 值高的活性成分在益肾健脾法核心药对的作用机制中起着较为重要的作用。在药物活性成分中，degree 靠前的是槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黄豆黄素、豆甾醇，degree 值分别为82、22、18、14、10。在基因中，degree 靠前的是NCOA2、PTGS2、PTGS1、AR、CASP3，degree 值分别为30、21、15、8、6。86 个节点中有68 个与3 个及3 个以上节点发生作用。以上统计分析提示益肾健脾法核心药物作用于多个靶点，也反映了益肾健脾中药治疗少弱精症多成分、多靶点的效应机制。通过分析益肾健脾中药对作用靶点与少弱精症的疾病靶点得到两者的共同靶点数为46 个。在应用R 语言绘制的PPI 网络图和频次图中，出现频次较高的有AKT、IL6、ESR1、EGFR 等。ESR1 是是6号染色体的基因，该基因编码雌激素受体，一种配体往往是受激活的转录因子影响，这就提示DNA结合和转录激活可能与少弱精症的发生有关［13-15］。此外，研究已经发现雌激素在调控男性生精功能方面起着至关重要的作用［16］。有研究报道睾丸支持细胞凋亡时涉及到多种信号通路的调控，包括线粒体途径、Fas/FasL 途径和JAK-STAT 通路等［17-19］，且Go 生物功能分析结果提示益肾健脾中药治疗少弱精症的潜在靶点参与氧化与抗氧化活性等生物学过程可能性大［20］。因此益肾健脾中药治疗少弱精症可能通过调控HIF-1、PI3K/Akt 等信号通路改善精子活力。此外，KEGG 通路富集分析结果提示益肾健脾中药改善男性少弱精症的作用机制可能与调控雌激素信号转导通路（estrogen signaling pathway）有关。PPI 共同靶点构建已经表明ESR1基因出现频次位列第三。因此，结合KEGG 富集分析结果可以推测益肾健脾中药改善男性少弱精整的作用机制可能与调控人内源性激素有关。

本研究以系统生物学为基本原则，从中医临床实践出发，应用网络药理学的研究方法，对益肾健脾中药治疗少弱精症的物质基础及其作用机制进行探析。 degree 值排名靠前的槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黄豆黄素、豆甾醇可能在益肾健脾中药的药理作用中发挥重要作用。得到46 个益肾健脾中药治疗男性少弱精症的可能靶点，可作为少弱精症核心治疗靶点的有AKT、IL6、ESR1、EGFR 等。此外，ESR1 作为雌激素受体基因在调控男性生精功能方面的作用不可忽视，益肾健脾中药改善男性少弱精整的作用机制可能与调控人内源性激素有关。以上结论为本病的临床实践提供更多的治疗方法，同时为深入的实验研究提供前期基础。然而基于当前网络药理学研究的局限性，本次研究结果尚需进一步的实验验证。