黄芩苷对氧糖剥夺再复氧损伤模型大鼠海马神经干细胞的保护作用

罗 晨 张 华 欧阳侃

神经干细胞（neural stem cells，NSCs）存在于胚胎和成年哺乳动物的嗅球、海马、齿状回、室管膜等脑区，其增殖、分化调控是神经再生的主要机制之一，对缺血性脑血管疾病所引起的神经损伤具有修复作用，但仅仅依靠内源性NSCs 难以弥补大量的神经元丢失或凋亡[1-2]。中医药可促进内源性神经再生与修复，是治疗缺血性脑血管疾病的潜在治疗策略[3]。研究证实，单味中药、中药有效成分、中药提取物以及中医复方对NSCs 具有调控作用，可以促进缺血性脑血管疾病神经发生与损伤修复[4]。黄芩苷是从黄芩中提取的一种黄酮类化合物，可诱导体外培养的胚胎皮层NSCs 分化为神经元，并抑制其向星形胶质细胞分化[5]。黄芩苷对在体全脑缺血/再灌注损伤大鼠海马NSCs 的增殖具有促进作用，并改善大鼠认知功能[6]。本实验拟采用体外氧糖剥夺/再复氧（OGD/R）损伤模型模拟体内脑缺血/再灌注损伤，观察黄芩苷对模型大鼠海马NSCs 的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新生24h 内的SPF 级SD 大鼠，雌雄不限，体质量250～300g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（浙）2013-0016，动物质量合格证号：2008001654872。动物房保持通风，室温22～25℃，湿度60%，12h 日光12h 黑夜，自由饮水采食，所有实验操作严格遵守实验动物的使用和管理原则。本动物实验经浙江省中西医结合医院伦理委员会审核备案。

1.2 主要试剂与仪器 黄芩苷（纯度：93.3%）由中国食品药品鉴定研究院提供（批号110715-2013181）；DMEM/F12 培养基（批号12400-024）、B27 添加剂（批号17504-044）均购于美国GIBCO 公司；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，批号AF-100-18B）、青霉素（批号0903311）均由美国Peprotech 提供；四甲基偶氮唑盐（MTT，批号111108）、兔抗BrdU 多克隆抗体（批号ab26890）、Triton X-100（批号V900502）均购于美国Sigma 公司；5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU 批号22905630），mil-lipore 公司；二甲基亚砜（DMSO，批号CAS #67-68-5）、胎牛血清（批号c2027050）、D-Hank's（批号H0321）、Earle's 液（批号114049）均由博士德生物工程有限公司提供；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（批号A020-2），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，批号28718-90-3）均购于碧云天生物技术有限公司；小鼠抗巢蛋白（Nestin）多克隆抗体（批号AN203）、山羊抗小鼠（Cy3 标记，批号115-165-044）、山羊抗兔（FITC 标记，批号10006588）均购于美国Chemicon 公司；AD340 型酶标仪（美国BECKMAN 公司）；IX71 型倒置相差显微镜（日本Olympus 公司）；CX41 型奥林巴斯荧光显微镜（日本Olympus）；PC1200D 型佳能数码相机（日本Canon），Radiance 2100TM 型激光共聚焦显微镜（中国Bio-Rad 公司）。

1.3 大鼠海马NSCs 培养和鉴定 将新生SD 大鼠脱颈处死，无菌条件下取出全脑并置于4℃预冷DHank's 中，在解剖显微镜下分离出海马组织，剪碎成小块并置于消化液中37℃孵育20min，入D-Hank's反复吹打，过滤、离心、去上清液，细胞重悬于含完全培养基的培养液（2%B27、青霉素、20ng/mL bFGF、DMEM/F12、100U/mL 青霉素）中，以密度2×105/mL接种于75cm2培养瓶中，记为P1 代；细胞在培养箱（37℃、体积分数5%CO2）孵育1 周后机械分离，按2×105/L 密度传代（P2 代），实验用细胞为P3 代。

海马NSCs 的鉴定采取Nestin[7]免疫荧光染色检测，具体步骤：细胞用4%多聚甲醛固定，漂洗，血清封闭，加入一抗小鼠抗Nestin（1∶200）4℃孵育过夜，漂洗，加入二抗山羊抗小鼠（Cy3 标记，1∶1000）室温避光孵育2h，漂洗，在暗室中采取CX41 型奥林巴斯荧光显微镜下观察并拍照。

1.4 实验分组与OGD/R 模型的建立 将P3 代海马NSCs 随机数字表法分为对照组、OGD/R 组、黄芩苷组。对照组：常规条件（37℃、5%CO2）下培养28h。OGD/R 组：将海马NSCs 接种于无糖Earle's 液，置于缺氧罐内，通入厌氧混合气体（95%N2和5%CO2），夹闭缺氧罐的出口和入口，37℃培养4h，然后换成正常培养液继续培养24h，即为OGD/R 模型。黄芩苷组：海马NSCs 接种于含黄芩苷（30μmol/L）的无糖Earle's 液中，置于缺氧罐内，通入厌氧混合气体（95%N2和5%CO2），夹闭缺氧罐的出口和入口，37℃培养处理4h，然后换成含黄芩苷（30μmol/L）正常培养液继续培养24h。

1.5 海马NSCs 存活率和LDH 漏出率检测 MTT法测定：将海马NSCs 接种于96 孔板，加入MTT 溶液（5mg/mL），室温孵育4h，弃除MTT 溶液，加入DMSO处理10min，在酶标仪上570nm 波长处测定细胞的光密度（OD）值；以对照组存活率为100%，各组细胞存活率=（OGD/R 组或黄芩苷组OD 值/对照组OD 值）。

比色法测定：收集每组海马NSCs 的培养液，加入2%Triton-X100 裂解细胞，收集裂解液；按LDH比色法试剂盒测定培养液和裂解液中LDH 含量。LDH 漏出率=培养液LDH 含量/（培养液LDH 含量+裂解液LDH 含量）×100%。

1.6 海马NSCs 凋亡检测 DAPI 测定：细胞加入含DAPI（1:1000）的缓冲液，室温避光处理5min，弃除DAPI 液，漂洗，在暗室中采取CX41 型奥林巴斯荧光显微镜下观察并拍照。

1.7 Nestin/BrdU 免疫荧光染色测定海马NSCs 增殖海马NSCs 加入含BrdU（6μg/mL）的缓冲液，4℃孵育24h。对海马NSCs 行Nestin/BrdU 免疫荧光染色：将海马NSCs 接种于培养板，贴壁3h，4%多聚甲醛固定，血清封闭，一抗混合液[小鼠抗Nestin（1:1000）和兔抗BrdU（1:1500）]4℃孵育过夜，PBS 缓冲液冲洗，二抗混合液[山羊抗小鼠（Cy3 标记）（1:1000）和山羊抗兔（FITC 标记）（1:1000）]室温避光孵育2h，漂洗，荧光显微镜下观察拍照。采用Image J 分析3 组细胞的Nestin/BrdU 阳性结果，每组随机取3 个细胞孔，每孔随机取5 个视野，计数细胞面密度和阳性细胞数。

1.8 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较进行单因素方差分析；P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 海马NSCs 培养及鉴定 原代培养3 天的海马NSCs 在倒置显微镜下以神经球的方式生长（见图1A）；细胞传代培养后经免疫荧光染色显示Nestin 表达呈阳性（见图1B）；提示所培养的细胞为NSCs，可用于后续实验。

2.2 黄芩苷对海马NSCs 存活率和LDH 漏出率的影响 MTT 法和比色法检测结果显示，OGD/R 组细胞OD 值和存活率下降，LDH 漏出率增加（P＜0.01）；与OGD/R 组相比，黄芩苷组细胞OD 值和存活率明显升高，LDH 漏出率显著降低（P＜0.01），见表1。

2.3 黄芩苷对细胞凋亡的影响 DAPI 染色显示，OGD/R 组大量细胞核萎缩，出现细胞凋亡碎片或小体，黄芩苷组细胞的上述现象明显改善，见图2。

图1 原代海马NSCs 培养及鉴定（免疫荧光染色×200）

表1 黄芩苷对海马NSCs 存活率和LDH 漏出率的影响（）

表1 黄芩苷对海马NSCs 存活率和LDH 漏出率的影响（）

注：对照组为常规条件（37℃、5%CO2）下培养的NSCs；OGD/R 组为氧糖剥夺NSCs；黄芩苷组为氧糖剥夺NSCs，予含30μmol/L 黄芩苷无糖Earle's 液；NSCs 为神经干细胞；LDH 为乳酸脱氢酶；OD 值为细胞光密度值；OGD/R 为氧糖剥夺再复氧；与对照组比较，aP＜0.01；与OGD/R组比较，bP＜0.01

2.4 黄芩苷对海马增殖的影响 免疫荧光染色检测NSCs Nestin/BrdU 表达显示，对照组、OGD/R 组、黄芩苷组均有Nestin/BrdU 阳性表达；对照组Nestin/BrdU阳性表达较丰富，阳性细胞之间连接较多，细胞周围有大量大小和长短不一的突起；OGD/R 组Nestin/BrdU 阳性表达位置无异常改变，但阳性细胞较少，细胞之间的连接和细胞周围的突起数量减少，且细胞周围的阳性碎片增多；OGD/R 组上述异常变化在给予黄芩苷后有所改善（见图3）。与对照组比较，OGD/R 组Nestin/BrdU 阳性表达的面密度及细胞数明显降低（P＜0.01）；黄芩苷组Nestin/BrdU 阳性表达的面密度、细胞数显著多于OGD/R 组（P＜0.01），见表2。

表2 黄芩苷对Nestin/BrdU 表达的影响（）

表2 黄芩苷对Nestin/BrdU 表达的影响（）

注：对照组为常规条件（37℃、5%CO2）下培养的NSCs；OGD/R 组为氧糖剥夺NSCs；黄芩苷组为氧糖剥夺NSCs，予含30μmol/L 黄芩苷无糖Earle's 液；Nestin 为巢蛋白；BrdU 为5-溴脱氧尿嘧啶核苷；OGD/R 为氧糖剥夺再复氧；与对照组比较，aP＜0.01；与OGD/R 组比较，bP＜0.01

3 讨论

缺血性脑卒中可引起神经元死亡或凋亡，及时恢复缺血区血液灌注，有利于脑内神经元再生，但会进一步加重缺血所致的神经损伤及脑功能、结构破坏，即发生缺血再灌注损伤[8]。体外OGD/R 微环境对NSCs 增殖、分化的影响是体外模拟缺血性脑卒中的重要模型之一，已被广泛用于脑卒中的各种动物实验研究中[9-10]。海马是NSCs 的主要分布脑区之一，该区域神经元与学习、记忆等功能联系密切。生理条件下NSCs 聚集的海马齿区域的氧体积分数为2.5%～3.0%，缺血性脑卒中发生时海马局部的氧体积分数接近于0，引起大量神经元丢失或死亡[11]。Nestin 是主要的胚胎中枢神经系统第Ⅳ类中间丝蛋白，且常表达在发育中枢神经系统中，而在已出现分化的胶质细胞及神经元中几乎不表达，在NSCs 标志物中，Nestin 被广泛认可[12-13]。本研究结果显示，原代培养的海马NSCs 在倒置显微镜下以神经球的方式生长，具有折光性强的特点，经免疫荧光染色后NSCs 细胞呈Nestin 阳性表达，提示本实验培养的细胞为NSCs。

图2 黄芩苷对细胞凋亡的影响（免疫荧光染色×200）

图3 黄芩苷对海马NSCs Nestin/BrdU 阳性表达的影响（免疫荧光染色×200）

本研究结果显示，与对照组比较，OGD/R 组细胞OD 值、存活率明显降低，LDH 漏出率显著增加（P＜0.01）。LDH 是活细胞胞浆内含酶之一，正常情况下不能通过细胞膜；当细胞遭到损伤或死亡时可释放至胞外，使细胞培养液中LDH 含量增高[14]，说明OGD/R 可降低细胞存活率以及引起细胞死亡。马浚宁等[15]采取OGD/R 诱导NSCs 损伤发现细胞增殖能力明显降低，且可促进细胞发生凋亡。本研究DAPI核染结果显示，OGD/R 组大量细胞核萎缩，出现细胞凋亡碎片或小体。

目前临床或研究领域对OGD/R 诱导大鼠海马NSCs 损伤的标准药未见报道，部分文献报道中药单体对海马NSCs 损伤具有保护作用，但其确切作用尚待研究证实[10]。本研究结果显示，黄芩苷（浓度为30μmol/L）可增强OGD/R 后细胞的存活率，减少LDH 漏出率，并减轻OGD/R 所引起的细胞凋亡。BrdU 是一种胸腺嘧啶衍生物，在细胞处于DNA 合成期时BrdU 可掺入新合成的DNA 中，经免疫组化染色法检测其表达可用于评价细胞的增殖状态[16]。本研究结果显示，OGD/R 组Nestin/BrdU 阳性表达位置无异常改变，但阳性细胞较少，细胞之间的连接和细胞周围的突起数量减少，且细胞周围的阳性碎片增多；OGD/R 组上述异常变化在给予黄芩苷后有所改善。本研究结果还显示，黄芩苷（浓度为30μmol/L）能明显提高Nestin/BrdU 阳性表达的面密度、细胞数，即改善OGD/R 抑制海马NSCs 的增殖。崔猛等[5]观察到7.5、15、30μmol/L 的黄芩苷均可促进体外培养的NSCs 向神经元分化，以30μmol/L 黄芩苷组最明显。林筱洁等[16]也发现，20μmol/L 的黄芩苷可通过调控线粒体自噬，减轻OGD/R 诱导的神经元损伤。综合以上研究表明，黄芩苷（浓度为30μmol/L）能减轻OGD/R 对大鼠海马NSCs 的损伤，并促进其增殖。但黄芩苷能否促进体内脑缺血性损伤后海马NSCs 的增殖、改善神经损伤，则有待进一步探讨。