微小核糖核酸在冠心病患者中的表达及与凝血功能的相关性

李玲，李宗州，路娜

（1.河南省职工医院 检验科，河南 郑州450000；2.河南省中医院检验科，河南 郑州450000）

冠心病是指因冠状动脉血管粥样硬化病变引起血管腔狭窄、阻塞，造成心肌缺血缺氧、坏死而导致的冠状动脉粥样硬化性心脏病[1]。世界卫生组织将冠心病分为无症状心肌缺血、心绞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭、猝死5种类型。现代临床常分为稳定性冠心病（Stable coronary heart disease，S CAD）与急性冠状动脉综合征（Acute coronary syndrome，ACS）[2]。冠心病是由免疫、遗传、环境等多种因素相互作用导致的一种炎性疾病，与季节变化、大量吸烟饮酒、情绪暴怒、暴食有关，常呈急性发作。表现为胸痛、休克、发绀、盗汗，严重者可发生猝死。冠心病发病机制复杂,常见有血栓形成学说、脂肪浸润学说、内皮损伤学说、炎症及免疫学说，其中血管内皮损伤学说是被公认且形成较久的冠心病发病学说[3]。有研究显示微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）与冠心病发生有紧密联系[4]。miRNA是一类内源性非编码小分子RNA，种类繁多,可调控细胞增殖分化及凋亡过程[5]。本研究通过观察冠心病患者血浆中miRNA水平,探究miRNA与冠心病患者凝血功能关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年7月-2018年12月本院收治冠心病患者84例作为观察组。纳入标准：⑴经冠状动脉造影检查诊断为冠心病；⑵年龄18~75岁；⑶至少一支冠状动脉狭窄程度>50%；⑷无血缘关系。排除标准：⑴伴有恶性肿瘤；⑵严重肝肾功能障碍；⑶近1月内有输血史；⑷感染及血液系统疾病；⑸妊娠及哺乳期妇女。另选取同期于我院体检合格健康者80例作为对照组。观察组年龄32~71岁,平均52.35±5.28岁，男性54例，女性30例。对照组年龄34~65岁,平均49.51±4.17岁，男性43例,女性37例。根据观察组冠心病不同类型，分为SACD组53例，ACS组31例。观察组与对照组年龄、性别基础资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得医学伦理委员会批准,所有受试者及家属对研究内容充分知晓，并自愿签署知情同意。

1.2方法

1.2.1 标本采集与凝血功能指标测定 观察组入院第二天清晨空腹抽取静脉血5ml，对照组于体检当日抽取同等量静脉血。采用枸橼酸钠抗凝。经低温离心分离血浆，保存于-80℃冰箱中。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELIS A)检测血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物（Thrombin antithrombinⅢ,TAT）、血浆纤维蛋白原（fibrinogen，Fg）、D-二聚体（D-dimers）、P-选择素（P-selectin）水平。

1.2.2 血浆miRNA提取与测定 将血浆从冰箱中取出后置于室温下融解，转移至干净不含RNA酶EP试管中待测。使用miRNA试剂盒（北京百泰克，型号：RP5301）提取血浆中miRNA。严格按照试剂盒说明书进行操作。具体步骤：⑴向EP试管中加入Trizol试剂，混匀置于室温下5min，加入200μl氯仿，混匀后置于室温3min，4℃离心15min，吸取上清液至新EP试管。⑵加入异丙醇，混匀，-20℃下孵育30min，4℃离心10min，弃去上清液。⑶洗涤沉淀，4℃离心5min，置于真空5～10min，至不完全干燥状态，加入焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水30μl溶解沉淀，保存于-80℃冰箱备用。

采用荧光定量PCR技术检测miRNA。检测原理：荧光定量PCR指通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记示踪，监控实时反应过程，建立标准曲线，通过计算机软件计算待测标本浓度[6]。PCR反应条件：95℃变性5s，60℃退火30s,延伸循环40次。测定前采用美国Bio-RadPCR仪（型号：C1000）将提取好的miRNA逆转录为cDNA。逆转录反应条件：37℃60min，95℃3min。逆转录完成后，使用美国ABI公司实时定量PCR仪（型号：ABI7500）检测miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335的Ct值。CT值指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，与标本起始浓度呈负相关。

血液采集均由本院检验科医师操作,所有凝血功能相关因子与miRNA提取与检测均由本院检验科持有PCR上岗证书检验医师操作。

1.2.3 评价观察组中的冠心病患者动脉狭窄程度（Gensini）采用Gensini积分评价体系判断观察组患者三支主要冠状动脉及其分支狭窄程度[7]。评价标准:动脉管腔狭窄≤25%积1分；25～50%积2分；50～75%积4分；75～90%积8分；90～99%积16分；100%积32分。以积分≤25为轻度狭窄（n=32）,26～49为中度狭窄（n=30）,50～100为重度狭窄（n=22）。积分均由冠心病患者主治医师评定。

1.3 观察指标⑴SACD组、ACS组及对照组vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin水平。⑵SACD组、ACS组及对照组miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335的Ct值。⑶SACD组、ACS组及对照组miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表达量。⑷不同动脉狭窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335的Ct值。⑸不同动脉狭窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表达量。⑹miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335与凝血功能指标及动脉狭窄程度相关性。

1.4 统计学方法 使用SPSS21.0软件进行数据分析，计量资料组内比较采用配对样本t检验，组间比较采用独立样本t检验，以（±s）表示，相关性分析采用spearman分析法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组受试者vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin表达水平比较 SACD组与ACS组vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin表达水平比较无显著差异(P＞0.05)；SACD组与ACS组vWF、Fg、TAT、Ddimers、P-selectin表达水平均明显高于对照组（P＜0.05），见表1。

2.2 三组受试者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比较 SACD组与ACS组miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比较差异无统计学意义(P>0.05)；SACD组与ACS组miRNA-96、miRNA-34a Ct值均明显低于对照组（P<0.05）；SACD组与ACS组miRNA-335Ct值高于对照组（P<0.05），见表2。

表1 三组受试者vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin表达水平比较

表2 三组受试者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比较

2.3 三组受试者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表达量比较 SACD组与ACS组miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）；SACD组与ACS组miRNA-96、miRNA-34a表达量均明显高于对照组(P<0.05)；SACD组与ACS组miRNA-335表达量均明显低于对照组（P<0.05），见表3。

表3 三组受试者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表达量比较

2.4 不同动脉狭窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比较 轻度狭窄组miRNA-96、miRNA-34aCt值高于中度及重度狭窄组，miRNA-335Ct值低于中度及重度狭窄组(P<0.05)；中度狭窄组miRNA-96、miRNA-34aCt值高于重度狭窄组，miRNA-335Ct值低于轻度狭窄组（P<0.05），见表4。

表4 不同动脉狭窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比较

2.5 不同动脉狭窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表达量比较 轻度狭窄组miRNA-96、miRNA-34a表达量均低于重度狭窄组，mi RNA-335表达量高于中度及重度狭窄组(P<0.05)；中度狭窄组miRNA-96、miRNA-34a表达量低于重度狭窄组，miRNA-335表达量高于重度狭窄组（P<0.05），见表5。

表5 不同动脉狭窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表达量比较

2.6 miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335与凝血功能指标动脉狭窄程度相关性 spearman相关分析显示,miRNA-96、miRNA-34a与vWF、Fg、TAT、TAT、D-dimers、P-selectin及动脉狭窄程度呈正相关（P<0.05）；miRNA-335与vWF、Fg、TAT、TAT、Ddimers、P-selectin及动脉狭窄程度呈负相关（P<0.05），见表6。

表6 miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335与凝血功能指标及动脉狭窄程度相关性

3 结论

miRNA几乎可参与冠心病患者所有血管内皮细胞、平滑肌细胞基因表达过程[8]。血管内皮细胞具有维持血管内皮完整性、抵御外界危险因子的能力,动脉血管内皮细胞受损是冠心病患者动脉粥样硬化的首要因素[9,10]。有研究发现冠心病患者血浆中miRNA-96、miRNA-34a水平较其它心血管疾病患者明显升高[11]。推测冠心病患者动脉粥样硬化与miRNA-96、miRNA-34a表达水平可能相关，降低其表达量可能可抑制动脉粥样硬化病变速度。miRNA-335位于7q32.2染色体上，与多种肿瘤发生密切相关[12]。血液中miRNA具有不被RNA酶分解，浓度不受时间、温度与酸碱度影响的优势[13]。近年来miRNA作为一种生物标记示踪物广泛应用于肿瘤及心血管疾病的临床研究中[14]。

vWF是血液中一种凝血因子,在血管内皮受损出血时，vWF能介导血小板凝血机制，促进血栓形成。在病理状态下,vWF异常升高时血栓大量增加，导致凝血功能发生异常。TAT是反映凝血系统激活与凝血酶生成的重要指标，TAT升高常见于血液高凝状态及血栓性疾病。Fg是纤维蛋白前体，在凝血过程中可促使血液凝固,其病理性升高会引起血栓、心肌梗死、恶性肿瘤。D-dimers是一种纤维蛋白降解产物，其含量与纤维蛋白呈正相关。Pselectin是血管内皮细胞上的一种大分子糖蛋白，主要介导粒细胞、单核细胞与血小板粘附聚集作用，其含量升高会影响血小板粘附聚集功能，使血栓异常增多[15]。vWF、Fg、TAT、D-dimers及P-selectin表达水平异常升高常提示机体凝血功能障碍，均是临床评估患者凝血功能常用指标。

本研究发现，SACD组与ACS组患者血浆中vWF、Fg、TAT、D-dimers及P-selectin表达量均明显高于对照组健康者，表明无论何种冠心病，患者都会出现凝血功能障碍情况。分析其原因，可能是由于冠心病发生时因冠状动脉血管阻塞,血管内皮细胞受损，血液凝血机制被破坏，出现各凝血相关指标表达异常现象。本研究发现，SACD组与ACS组患者miRNA-96、miRNA-34aCt值均明显低于对照组，miRNA-335Ct值明显高于对照组；SACD组与ACS组miRNA-96、miRNA-34a表达量均高于对照组，miRNA-335表达量低于对照组。且本研究发现,动脉血管管腔轻度狭窄组中miRNA-96与miRNA-34a表达量均低于重度狭窄组、miRNA-335表达量高于中度及重度狭窄组。表明冠心病患者miRNA-96与miRNA-34a表达量越低、miRNA-335表达量越高，冠心病患者病情越轻，反之病情越重。提示临床治疗时可能通过降低miRNA-96与miRNA-34a表达量、升高miRNA-335表达量，减轻冠心病患者动脉狭窄程度。有研究显示凝血功能强弱与冠心病血管意外严重程度密切相关,冠心病患者动脉狭窄程度越高,其凝血功能障碍情况越重[16]。spearman相关分析显示,miRNA-96、mi RNA-34a表达水平与各凝血功能指标水平及动脉狭窄程度呈正相关，miRNA-335表达水平与各凝血功能指标及动脉狭窄程度呈负相关。表明高动脉狭窄程度、高凝血功能指标水平的冠心病患者miRNA-96与miRNA-34a表达水平越高，miRNA-335表达越低。

综上所述，凝血功能指标vWF、Fg、TAT、Ddimers及P-selectin水平异常升高表示凝血功能发生障碍,冠心病患者动脉狭窄程度随各凝血功能指标水平升高而增大,不同动脉狭窄程度冠心病患者各miRNA均出现表达异常情况。冠心病动脉狭窄程度、凝血功能发生障碍与miRNA-96、miRNA-34a表达量呈正相关,与miRNA-335表达量呈负相关。miRNA表达水平能作为临床评估冠心病严重程度及凝血功能的辅助诊断指标,并为冠心病患者后续治疗提供参考价值。