Wnt1、β-catenin、TCF4水平变化对结直肠癌患者预后的影响

崔瑛

（许昌市人民医院质控办，河南 许昌461000）

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是世界上最常见的癌症类型之一，每年约新发病例100万例，在所有癌症中发病率居第三位,严重影响人们的生活质量[1]。目前,结肠癌的治疗方法涉及手术、化疗、靶向治疗等多种治疗方法,取得了一定的效果[2]。然而，部分患者治疗后往往复发，不利于患者改善预后。因此，预测术后预后和选择合适的辅助治疗是非常重要的，尤其对于II、III期CRC患者。虽然术前肿瘤标志物、肿瘤-结节-转移（TNM）等多种临床病理因素已被报道为影响预后的因素,但对复发高危患者的识别并不容易[3]。近年来，分子标记作为预测预后的标志物在CRC中得到了广泛的关注。

无翼/集成（Wingless/Integrated，Wnt）信号通路是胚胎发育和成人组织中控制细胞行为规范的基本进化保守信号机制之一[4]。异常的Wnt信号通路激活与各种癌症在内的多种疾病发生相关[5]。有三种不同的Wnt信号通路：β-连环蛋白(β-catenin)通路、钙离子依赖（calcium-dependent）通路和平面细胞极性通路(planar cell polarity pathway)。三个Wnt信号通路进一步可分为规范和非规范信号通路，其中β-catenin通路，属于规范的途径,具有促进肿瘤细胞生长和增殖的作用[6]。为此,本研究对2011年5月至2014年5月期间106例TNM II期或III期CRC患者组织中Wnt/β-catenin信号通路及相关因子进行检测,分析其与CRC预后的相关性，报告如下。

1 资料和方法

1.1 资料来源 收集2011年5月至2014年5月我院收治的TNM II期或III期CRC患者106例，男61例，女45例，年龄33～85岁，平均61.9±15.7岁，均经组织病理学确诊，排除合并其它恶性肿瘤以及术前行放化疗等治疗的患者。

1.2 检测方法 使用TRIzol（（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）试剂盒从组织中提取总RNA。采用TaKaRa Reverse Transcription Kit（TaKaRa，Dalian，China）将RNA逆转录为cDNA，反应条件为37°C 15 min，85°C 5s。然后将1:10稀释的2μl cDNA加入25μl的反应体系（PCR mix 12.5μl、ROX 0.5μl、正向引物1μl、反向引物1μl和H2O 8μl），试剂盒采用TaKaRa公司的Power SYBR Green，反应条件为95 C变性30s，其次为95°C 5s、退火温度下34秒的35循环，最后溶解曲线分析。仪器采用ABI Prism 7700 Sequence Detection System实时荧光定量PCR仪。采用βactin和GAPDH作为内参基因。Wnt1、β-catenin、TCF4、β-actin和GAPDH扩增引物序列见表1。

表1 基因PCR扩增引物序列及退火温度

1.3 统计学方法 经Kolmogorov-Smirnov分析，各组水平数据呈正态分布，用平均值±标准差（±s）表示,组间比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,采用统计学分析软件SPSS19.0进行分析。

2 结果

2.1 Wnt1、β-catenin、TCF4在CRC患者组织中的表达 CRC患者癌组织中Wnt1、β-catenin、TCF4 mRNAs表达水平明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义（P<0.001）。见表2。

表2 Wnt1、β-catenin、TCF4在CRC患者组织中的表达（±s）

表2 Wnt1、β-catenin、TCF4在CRC患者组织中的表达（±s）

组别 例数癌旁正常组织癌组织t值P值106 106 Wnt1 β-catenin 1.07±0.56 3.25±1.61 14.343<0.001 0.97±0.63 5.33±2.96 19.967<0.001 TCF4 1.03±0.57 7.18±3.53 23.517<0.001

2.2 Wnt1、β-catenin、TCF4的表达与CRC患者临床病理参数的关系106例CRC组织中Wnt1的表达与肿瘤大小、浸润程度和局部淋巴结转移密切相关（P<0.05）；β-catenin的表达与分化程度、浸润程度和局部淋巴结转移密切相关（P<0.05）；TCF4的表达与浸润程度和局部淋巴结转移密切相关（P<0.05）。三项指标均与与患者年龄、性别和肿瘤部位无关（P均>0.05）。见表3。

2.3 Wnt1、β-catenin、TCF4表达与CRC患者预后的关系 106例CRC患者的随访时间为3~60个月，中位随访时间为28.9±11.2个月。随访期间59例发生死亡，死亡率为55.7%。COX单因素分析,浸润程度、局部淋巴结转移、Wnt1、β-catenin和TCF4是CRC患者预后的影响因素；进一步纳入多因素模型进行分析,显示局部淋巴结转移、Wnt1、βcatenin和TCF4是CRC患者预后的独立因素。见表4。

3 讨论

TNM分期临床上决定CRC患者预后的重要标准,其中TNM II期和III期肿瘤约占CRC患者的70%[7]。虽然研究显示多学科联合治疗成功地诱导了约60%的II期和II期临床缓解,但目前关于II期和III期患者的治疗方案选择仍存在较大争议。NCCN指南规定，治疗原发性非转移性结肠癌的手术和辅助全身治疗,后者需要根据病理分期和临床特点。通常认为,辅助化疗通常可以提高III期CRC患者的无病生存率，然而，T1-2N1M0肿瘤（IIIA期）患者的生存率明显高于IIB期肿瘤患者，并且相当一部分III期患者仅仅遭受化疗的副作用，提示辅助化疗需要优化[8]。同时研究显示[9]，约30%的组织学上没有淋巴结受累的CRC患者术后5年内死于远处转移或局部复发，提示单纯的TNM分期不能充分预测CRC的临床进程。因此，寻找其它有效指标准确地识别II期高危患者和III期低复发风险患者，显得迫切需要。

表3 Wnt1、β-catenin、TCF4的表达与CRC患者临床病理参数的关系

表4 COX分析影响CRC患者整体生存的预后因素

Wnt信号通路在维持正常细胞稳态和胚胎发育中发挥重要作用,目前已知其与包括CRC在内的多种肿瘤进展相关[10]。Wnt蛋白是分泌糖蛋白，是Wnt信号通路的配体。Wnt有19个亚型，Fz有10个亚型，它们具有相同的遗传结构同源性。单个Wnt配体和Fz受体可以激活不同疾病的典型或非典型通路，因此Wnt信号通路非常复杂。在目前的研究中，我们关注Wnt1/β-catenin通路。Wnt-1最初被认为是小鼠乳癌病毒（mouse mammary tumor virus，MMTV）插入激活的靶点,从而导致乳腺增生。在哺乳动物细胞中，Wnt-1被认为是一种分泌的生长因子，与细胞表面结合同源Fz受体相互作用时，产生Wnt信号级联反应,从而影响细胞的各种功能,包括细胞的运动性、极性和增殖[11]。在细胞内部，信号通过散体蛋白（dsh）和zesti-white 3-糖原合成酶激酶3~（zw3/GSK3）基因的蛋白产物进一步转导[12]。Wnt1可以调节肿瘤细胞形态上的变化，这些变化有利于肿瘤细胞的转移[13]。本研究中，106例CRC患者癌组织中Wnt1的表达要明显高于癌旁正常组织，并且与肿瘤大小、浸润程度和局部淋巴结转移密切相关（P<0.05），提示其在CRC发生发展中起到重要作用。

β-catenin是一种多功能蛋白,主要结构包括130个氨基酸氨基末端结构域、包含42个氨基酸的12个不完全重复（又称，Arm重复）和100个氨基酸的羧基末端结构域。β-catenin的氨基端对调节该蛋白的稳定性具有重要作用,而羧基端融合到GAL4 DNA结合域时,可起到激活转录的作用[14]。除了在粘附连接处的结构功能外，β-catenin在Wnt配体刺激的细胞的细胞质中积累，并介导细胞核中的Wnt信号转导，而β-catenin的累积是Wnt信号转导的关键事件。核β-catenin与淋巴增强子结合因子/T细胞因子（LEF/TCF）家族的DNA结合蛋白结合,从而将TCF从转录抑制因子转化为激活因子[15]。TCF/β-catenin复合物进一步上调Wnt的靶基因如c-myc，cyclin D1、CD44、Axin2和SP5的表达[16]。在没有Wnt刺激的情况下，细胞质中的β-catenin可与酪蛋白激酶1α（CK1α）和糖原合成酶激酶3（GSK-3）等形成细胞质蛋白复合物。最终，氨基端磷酸化的β-catenin被泛素化并随后被蛋白酶体破坏[17]。β-catenin可通过同时与E钙粘蛋白和α钙粘蛋白结合,将粘附分子连接到细胞骨架聚合物肌动蛋白上,细胞粘合连接并且核βcatenin表达升高被认为是异常β-catenin信号通路激活和促进肿瘤进展的迹象[18]。Xu等[19]研究发现，细胞核中β-catenin的升高与肿瘤患者的与不良预后相关。本研究结果显示，CRC癌组织中βcatenin的表达与分化程度、浸润程度和局部淋巴结转移密切相关（P<0.05），与相关报道一致。

TCF4对于小肠和结肠上皮细胞的胚胎发育和成体组织稳态至关重要。当在高迁移率族DNA结合结构域序列的紧邻上游插入产生潮霉素B磷酸转移酶的表达盒时，TCF4可被全身敲除，从而导致小鼠由于小肠失去增殖能力而在围产期死亡[20]。Wang等[21]研究显示，肠组织中TCF4的靶向缺失伴随着小肠和结肠中增殖细胞的丧失。同时，谱系示踪实验表明,成年Tcf4缺陷的小肠和结肠干细胞不会促进上皮自我更新[22]。Hua等[23]研究显示，TCF4是CRC的发生、发展的重要因素。本研究结果也显示TCF4在CRC癌组织中明显升高,并且其表达与浸润程度和局部淋巴结转移密切相关(P<0.05)。COX多因素模型进行分析显示，TCF4和Wnt1、β-catenin均是CRC患者预后的独立因素。

综上所述,Wnt1、β-catenin和TCF4可以有效预测TNM II期和III期CRC患者的预后,便于临床制定更有效的CRC综合治疗方案。