福建省不同来源沙门菌中pagC-msgA毒力小岛分布特征

黄梦颖，陈建辉，邱玉锋，李曲文，徐海滨，杨劲松

（福建省疾病预防控制中心 福建省人兽共患病研究重点实验室，福建 福州350001）

沙门菌是全球重要的食源性肠道致病菌之一，其感染谱广泛，能在人与人、动物与人、动物与动物之间传播。人类感染沙门菌后可处于持续无症状携带状态、短暂轻度肠胃炎状态和严重的全身性感染状态[1,2]。其中,无症状携带者可持续由粪便排出沙门菌长达一年及以上,也是重要的传染源[3]。沙门菌毒力岛[4-6]（Salmonella Pathogenicity islands,SPI）是毒力基因在沙门菌的染色体或质粒上成簇分布的特定区域。SPI可以通过接合、转导、转化等方式在沙门菌之间,甚至是跨种属细菌之间进行水平转移（horizontal gene transfer,HGT）。SPI与沙门菌的致病性密切相关。本文通过对福建省沙门菌腹泻患者与健康人群分离株中毒力小岛pagCmsgA分布特征的研究,进一步探索本省沙门菌的毒力特点，为有效防控本省沙门菌爆发提供科学可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株来源 166株沙门菌是福建省其它感染性腹泻监测与省属食品从业人员健康体检中分离留存的：其中腹泻患者分离株121株、健康人群分离株45株。

1.2 主要试剂与仪器 常用培养基：营养肉汤、营养琼脂等（北京路桥）；PCR反应试剂、DL2000 Marker（Takara）；琼脂糖、溴化乙锭(10 mg/ml)等（上海生工）。Veriti Dx扩增仪（美国AB）；Basic电泳仪；Gel Doc XR+凝胶成像系统（美国Bio-Rad）。

1.3 PCR检测

1.3.1 引物设计 引物序列及扩增片段长度来自参考文献[7]，合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3.2 DNA模板制备 采用煮沸法提取实验菌株DNA。从普通营养琼脂平板上刮取适量纯菌落于300μL纯水中制成菌悬液。沸水浴10min,冰浴10 min,12000r/min离心10min,吸取上清作为PCR模板。-20℃保存备用。

1.4.3 PCR反应体系及条件 反应体系（20μl）：premix 10μl，上、下游引物（100μM）各0.3μl，DNA模板2.0μl,加纯水至20μl。反应条件：(95℃5min)+30×(95℃30s+55℃30s+72℃30s)+(72℃5 min)。

1.4.4 PCR反应产物的检测 取5ul PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，Gel Doc XR+凝胶成像系统观察拍照。

1.5 统计分析 运用SPSS17.0进行数据的整理与分析。组间比较采用卡方检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 沙门菌腹泻患者与健康人群分离株中毒力基因pagC与msgA的携带情况分析 166株沙门菌分离株中毒力基因pagC与msgA的总检出率分别为40.96%(68/166)和56.02%(93/166)。这两个毒力基因在沙门菌腹泻患者分离株与健康人群分离株中的携带情况相似,差异无统计学意义(χ2pagC=0.089,P=0.766；χ2msgA=1.915,P=0.166)。在两个组别中,毒力基因pagC的携带率分别为39.67%（48/121）和42.22%（19/45）；毒力基因msgA的携带率分别为58.68%（71/121）和46.67%（21/45）。见图1和表2。

图1 沙门菌腹泻患者与健康人群分离株中毒力基因pagC与msgA PCR检测图

表2 沙门菌腹泻患者与健康人群分离株中毒力基因pagC与msgA的携带情况

2.2 沙门菌腹泻患者与健康人群分离株中毒力基因携带模式情况分析 166株沙门菌分离株中，毒力基因pagC与msgA的携带模式分为4种：VP1：pagC+msgA-（4.85%）、VP2：pagC-msgA+（20.00%）、VP3：pagC+msgA+（36.36%）及VP4：pagC-msgA-（38.79%）。在沙门菌腹泻患者与健康人群分离株中，毒力基因pagC与msgA的携带模式基本一致，差异无统计学意义(χ2VP1=1.255,P=0.263；χ2VP2=1.519,P=0.218；χ2VP3=0.134，P=0.714；χ2VP4=0.488,P=0.485)。最常见的携带模式是VP3：pagC+msgA+及VP4：pagC-msgA-,在两个组别中的占比分别为37.19%、37.19%和34.09%、43.18%。见表3。

3 讨论

革兰阴性菌外膜的主要成分是外膜蛋白,其占比约为50%[8]。外膜蛋白不仅维持细菌正常形态、参与细菌物质代谢，而且在细菌的耐药及致病过程中也发挥着重要作用[8,9]。沙门菌毒力基因pagC[10-17]是由水平转移获得的,其编码一种外膜蛋白。该蛋白由185个氨基酸组成,与Ail、OmpX、Rck、Lom等蛋白具有高度同源性,属于同一个外膜蛋白家族。在低Mg2+的环境中，PagC蛋白受PhoP-PhoQ双组分系统调节。目前已知PagC在巨噬细胞内生存及全身感染过程中起一定作用。沙门菌毒力基因msgA[10,18]编码的蛋白上没有信号序列，是一种非包膜蛋白的小蛋白。msgA与pagC具有相似的毒力表现型,其也是巨噬细胞内生存及小鼠毒力所必需的。但是，二者在调节及种系遗传分布方面并不相同：msgA与志贺菌中一些隐蔽性质粒上的DNA区域具有同源性；msgA的表达不受pho蛋白调节；msgA杂交序列可在缺乏pagC基因的肠道细菌中检测到。本文就选取了这两个染色体上位置相近、功能相似的毒力基因组成的毒力小岛进行研究。

表3 沙门菌腹泻患者与健康人群分离株中毒力基因携带模式分布情况

本研究中发现,福建省沙门菌中均检出一定比例的毒力基因msgA与pagC，检出率分别为40.36%和55.42%。但是，腹泻患者分离株和健康人群分离株中这两个毒力基因的分布情况相似，不存在显著差异（χ2pagC=0.089，P=0.766；χ2msgA=1.915，P=0.166）。虽然我省沙门菌中这两个毒力基因的检出率要低于其他国家或地区,但是它们在腹泻患者和健康人群分离株中的分布情况与之前报道的对鸟类和火鸡中分离株的研究结果是一致的[19-23]。有趣的是Migma Dorji Tamang对猪中分离株的研究发现，毒力基因msgA与pagC在病猪中的携带率高于健康猪，特别是pagC基因的携带率病猪中是明显高于健康猪[24]。这与我们的研究结果不一致。这可能是由于毒力基因msgA与pagC在不同宿主体内的作用机制存在一定差异。具体情况需要更多的实验研究来探索。

福建省沙门菌含有4种毒力基因携带模式。在沙门菌腹泻患者与健康人群分离株中,毒力基因pagC与msgA的携带模式基本一致，差异无统计学意义（χ2VP1=1.255,P=0.263；χ2VP2=1.519,P=0.218；χ2VP3=0.134，P=0.714；χ2VP4=0.488，P=0.485）。有报道称，msgA杂交序列可在缺乏pagC基因的肠道细菌中检测到[18]。而且，在遗传和水平转移过程中可能由于某些原因基因发生丢失。所以，无论是从整体来看，还是分组别来看，VP1：pagC+msgA-占比较低，而且要明显低于VP2：pagC-msgA+。VP3：pagC+msgA+及VP4：pagC-msgA-为最常见的基因携带模式。VP4：pagC-msgA-模式的存在说明在沙门菌中可能存在其他的作用机制来完成巨噬细胞内生存及全身性感染，例如毒力基因spiA[25]。

综上所述,福建省沙门菌pagC-msgA毒力小岛在腹泻患者与健康人群分离株中的分布情况相似,不存在差异性。本省沙门菌健康人群分离株也具有一定的致病性，和腹泻患者分离株一样，感染人后有可能会引发一系列的症状。所以，对从业人员需要加强食品安全相关知识培训,提高其食品安全意识。同时，相关部门需要强化饮食安全的监督和管理工作，规范从业人员行为。从而避免从业人员成为传染源，防止发生沙门氏菌感染爆发。