沙门氏菌H鞭毛抗原纯培养和位相变异方法改进及效果的分析

赵卫红，黄曾，邹锦群，詹卓蓬，丁欣悦，龚怡静

（1.丰城市疾病预防控制中心检验科，江西 丰城331100；2.武汉体育学院研究生院健康科学院，湖北 武汉430079）

沙门氏菌可以通过水源、食物等途径引起食物中毒,败血症等病，85%的食物中毒是由沙门氏菌引起[1]。GB29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》中沙门氏菌是主要限量菌之一，且限量为0cfu/25g或ml,为所有微生物限量标准中的最严格级[2]。

沙门氏菌对人类的威胁已超过数百年,全球每年有超过1亿人感染。在亚太地区,每10万人中有32人感染,其中东亚地区最严重,每1O万人中有3600人感染,全球每年因沙门氏菌而死亡的人数高达15.5 万人,死亡率居亚洲国家和东南亚国家最高[3]。我国每年至少200万人感染沙门氏菌，造成成千上万人住院，数百人因此而死亡[4]。据世界卫生组织报告,世界各国沙门氏菌食物污染日益严重，造成巨大经济损失[5]。

近年来沙门氏菌检测与分型手段有了长足进步,但大部分是基于核酸的分子生物学等检测技术,这些方法门槛要求高，成本贵，限制了其在基层应用[6]。在基层常用的传统检测方法中，血清学分型是沙门氏菌命名及菌株溯源的关键步骤，但实际检测过程中沙门氏菌的血清分型工作量大、步骤繁杂，灵敏度低，尤其是沙门氏菌H鞭毛抗原难以检测，常需诱导多次[7]，导致整个检测过程耗时长、易出错、成本高[8]，人员劳动强度大。有报道显示，沙门氏菌H鞭毛抗原较易发生H-O变异[7]，而H鞭毛抗原如何恢复表达的有关报道很少[1]。所以,实现H鞭毛抗原的快速、低成本、高成功率的诱导表达对沙门氏菌的快速检测和分型具有十分重要的意义。本研究探讨沙门氏菌H鞭毛抗原纯培养和H鞭毛抗原诱导方法的改进,使沙门氏菌的血清学分型工作省时、简单、高效、成本低，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验菌株 ⑴2020年3月-5月份对禽类、水产品等120份样品做沙门氏菌检测获得14株沙门氏菌菌株：有典型生化反应、A-F O多价阳性、O单因子抗原鉴定阳性、需要鉴定H鞭毛抗原的沙门氏菌菌株。⑵其他16份已经血清学分型鉴定了的沙门氏菌菌株来自江西省疾病预防控制中心和宜春市疾病预防控制中心。⑶试验标准菌株是由省疾病预防控制中心提供。

1.2 试验试剂PCA、布氏肉汤、BPW（缓冲蛋白胨水）、SC（亚硒酸盐胱氨酸）、TTB(四硫磺酸钠煌绿）、BS（亚硫酸铋）、沙门氏菌显色琼脂平板、沙门氏菌生化鉴定试剂、半固体、双糖铁(青岛高科技园海博生物技术有限公司)、沙门氏菌诊断血清（宁波天润生物药业有限公司）等，试剂均在有效期内使用。

1.3 仪器与设备 YC-180澳柯玛冰箱（澳柯玛股份有限公司）、JM-A电子天平（诸暨市超泽衡器设备有限公司）、BSC-1300ⅡA2生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）、CJV1500T洁净工作台（山东新华医疗器械厂）、LMQ.C立式灭菌器（山东新华医疗器械厂）、5V电动移液枪（DLAB Scientific Inc）

1.4 方法 试验整个过程用沙门氏菌标准菌株作对照

1.4.1 检测前准备 120份禽类及其内脏、水产品，兽类等样品按照GB 4789.4-2016检测鉴定沙门氏菌。获得14株沙门氏菌：有典型生化反应、A-F O多价阳性，O单因子抗原鉴定阳性，需要鉴定H鞭毛抗原的沙门氏菌菌株。

配制所需试剂，高压灭菌所需器材、试剂，复苏菌株，划线接种至沙门氏菌显色琼脂平板，36℃24h培养后，挑单个典型菌落试验。对30株沙门氏菌菌株鉴定生化反应情况、A-F O多价阳性，O单因子抗原鉴定阳性。

1.4.2 沙门氏菌菌株纯培养后H鞭毛抗原血清学鉴定 30株沙门氏株按照：同一株沙门氏菌同时用两种试验法做纯培养后H鞭毛抗原血清学鉴定（一）依据GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验》：从沙门氏菌显色琼脂平板挑紫红色，半透明，中等大小的菌落直接划线接种到普通营养琼脂平板上，36℃24h纯培养后，用沙门氏菌诊断血清检测H鞭毛抗原（二）改进的沙门氏菌纯培养试验法：从沙门氏菌显色琼脂平板挑紫红色，半透明，中等大小的菌落直接涂布接种到加了1.5ml布氏肉汤的PCA琼脂平板上，36℃24h纯培养后，用沙门氏菌诊断血清检测H鞭毛抗原因子，二者进行24h时间培养后两相H鞭毛抗原都检出来的阳性率比较。

1.4.3 沙门氏菌H鞭毛抗原位相变异试验法 同一株沙门氏菌（按照GB4789.4-2016沙门氏菌H鞭毛纯培养法检验只检出一相H鞭毛抗原的22株沙门氏菌）同时用二种试验法做H鞭毛抗原位相变异培养（一）依据GB4789.4-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》位相变异试验法之一简易平板法：将0.35%--0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取已经检查出来的H鞭毛抗原因子诊断血清1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌，36℃24h培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌，用没有检测出相对应的沙门氏菌H鞭毛抗原诊断血清检测H鞭毛抗原（二）改进的沙门氏菌H鞭毛抗原位相变异试验法：在滴加了1小滴布氏肉汤的小玻璃管中滴加已检出鞭毛H相对应的沙门氏菌H鞭毛抗原诊断血清1小滴，混匀，从沙门氏菌纯培养的营养琼脂平板上用接种针挑取菌接种到混匀的液体中，36℃24h培养后，用没有检测出来的另外一相沙门氏菌H鞭毛抗原诊断血清检测H鞭毛抗原，二者进行24h培养后H鞭毛抗原检出的阳性率比较。

1.5 统计方法 采用SPSS19.0统计软件对数据进行分析，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验。

2 结果

2.1 120份样品中检出14株沙门氏菌菌株的情况禽 类、禽类的内脏、水产品中沙门氏菌检出阳性率较高，沙门氏菌污染较严重。

表1 120份样品中检出沙门氏菌菌株的情况

2.2 两种沙门氏菌纯培养方法培养24h后两相H鞭毛抗原都检出的阳性率比较P<0.01差异有统计学意义。

表2 两种沙门氏菌纯培养方法培养24小时后检出两相H鞭毛抗原的阳性率比较

2.3 两种沙门氏菌位相变异方法培养24h后H鞭毛抗原检出的阳性率比较P<0.01差异有统计学意义。

表3 两种沙门氏菌位相变异方法培养24小时后H鞭毛抗原检出的阳性率比较

3 讨论

非伤寒沙门氏菌病是全球范围内血液感染的主要原因之一，每年发病率340（210~650）万的病例（总发病率49/10万），发病人数也多（190[130~290]万病例）非洲发病率最高（227/10万），发病人数也多（190[130~290]万病例），其中婴幼儿和青年人受影响最大，病死率为20%，是全球疾病和死亡的主要原因之一[9]。通过对本市120份样品沙门氏菌检测情况分析,禽类、禽类的内脏、水产品中沙门氏菌检出阳性率较高,本市食品中沙门氏菌污染较严重。沙门氏菌是重要的食源性致病菌,能引起人和动物中毒并引起多种严重的疾病,对人类健康造成了巨大危害[10]。有关报道其中生禽肉中沙门氏菌的检出率最高为37.5%[11]，如表1本实验室生禽肉中沙门氏菌的检出率最高为23.33 %,比报导结果低,可见沙门氏菌污染食品中生禽肉比较严重[12]，而禽肉是人们餐桌上常见的食物，沙门菌是食源性疾病的主要致病菌[13]，沙门氏菌的污染则是严重危害公众健康的大问题[14]。因此提高沙门氏菌检测鉴定分型效率是十分必需的，改进沙门氏菌H鞭毛抗原检测方法，提供省时、简单、高效，低成本的方法，具有重要意义。

对沙门氏菌检测的研究文献比较多：沙门氏菌鞭毛抗原及其多样性研究进展[15]、A novel DNA quantum dots/aptamer-modified gold nanoparticles probe for detection of Salmonella typhimurium by fluorescent immunoassay（新型DNA量子点/适体修饰金纳米粒子荧光免疫 探针检测鼠伤寒沙门菌）[16]、Recombinase Polymerase Amplification(RPA)Combined with Lateral Flow Immunoassay for Rapid Detection of Salmonella in Food（重组酶聚合酶扩增（RPA）结合侧向流免疫法快速检测食品中沙门氏菌）[17]等。这些方法快速，但它针对沙门氏菌核酸等分子生物学检测，有些不能分型检测，试验、操作过程等易受环境污染影响结果，技术条件、环境要求高，需要高精密仪器与设备，成本高，如PCR方法就有局限性,死亡菌体也检出强阳性[18],不适应疾病预防控制中心等基层医疗单位应用。我国对沙门氏菌H鞭毛抗原检测研究的文献比较少：《搭桥法诱导肠炎沙门氏菌鞭毛抗原及鉴定》[1]、《一株 发酵乳糖且位相变异的鼠伤寒沙门氏菌的鉴定》[19]、《沙门氏菌血清学分型》[20]。这些方法细菌培养需时长，检测结果滞后，操作繁杂、易受污染影响结果，技术高、成本高，不很适应基层。

目前，全世界已发现2500多种沙门氏菌血清型[21]，我国目前发现一千多种沙门氏菌[22]，且沙门氏菌鞭毛抗原易发生H—O变异、抗原复杂、多样性[13]；变异诱导培养经常5～6次都难检出[7]。食品经过加工，由于加热、干燥、高含盐量、酸和冷冻等因素的作用、平板含水份过少导致鞭毛发育不良；培养基中某些成分抑制鞭毛生长；营养成分含量不够；培养温度不合适；某些菌株冷冻过久，性状发生变异等，这些因素都可能使沙门氏菌的鞭毛丢失或产生困难[1]。沙门氏菌检测采用GB4789.4-2016分离纯培养和位相变异方法，灵敏度低、反复多次所需时间长、消耗试剂多,成本高、操作繁杂、结果滞后、人员劳动强度大。所以沙门氏菌H鞭毛抗原检测鉴定方法改进研究，使其方法快速、简单、低成本、高成功率的诱导表达，提高效率是非常有必要的。

表2 中两种沙门氏菌纯培养方法培养24h后检出两相H鞭毛抗原的阳性率结果比较P＜0.01差异有统计学意义；表3两种沙门氏菌位相变异方法培养24h检出H鞭毛抗原的阳性率结果比较P＜0.01差异有统计学意义。沙门氏菌按照常规GB4789.4-2016纯培养法和鞭毛位相变异法检测H鞭毛,用普通营养琼脂平板和半固体琼脂培养,营养成分只有蛋白胨和牛肉浸出粉；而改进法纯培养法和H鞭毛位相变异法检测H鞭毛用的是PCA和布氏肉汤，PCA的营养成分中有胰蛋白胨和酵母浸粉；布氏肉汤的营养成分中有蛋白胨、酵母浸粉、胰酪蛋白胨。PCA和布氏肉汤的营养成分丰富，并含有酵母浸粉，有利于加速细菌发育繁殖,能刺激沙门氏菌H鞭毛发育[8],酵母增菌肉汤的液体环境更有利沙门氏菌H鞭毛生长[8]；实验中：改进的沙门氏菌纯培养方法培养24h后检出两相H鞭毛抗原的阳性率为73.33%；改进的沙门氏菌位相变异方法培养24h后检出H鞭毛抗原的阳性率86.36%。改进的纯培养和位相变异的检出率提高了，检出时间缩短了，灵敏度提高了，避免了反复转种鉴定都检不出来的困难,是基层疾病预防控制中心应对突发公共卫生事件迫切需要的；改进的纯培养和位相变异法所用的器材：9cm平皿、接种针、吸管培养箱等，试剂都比较简单、易得、操作简便、技术条件简单，只要高压灭菌，整个过程注意无菌操作、生物安全。与GB4789.4-2016的方法相比只是多了一种布氏肉汤，不需要增加任何仪器设备和其他试剂。减轻了试剂配制、灭菌、清洗、等环节工作量，降低了各环节污染风险和实验室环境污染风险。是现在物资困乏，任务繁重的基层疾医疗急需的。所以改进的沙门氏菌纯培养和位相变异法技术操作简便、检出率高、成本低、检出时间短，灵敏度高，具有经济及时间效益,有利于基层医疗沙门氏菌鉴定技术的推广应用。

综上所述,改进的沙门氏菌H鞭毛抗原纯培养和位相变异方法,在24h间内H鞭毛抗原检出阳性率高、检出时间缩短了、操作简便、所用的仪器设备简单,在现有的基层上不需要添加任何仪器设备,试剂少、成本低，比较易得、技术条件、环境简单,减少人员的劳动强度，为基层医疗提供了省时、简单、高灵敏度、高经济效益的方法。改进的沙门氏菌H鞭毛抗原纯培养和位相变异方法具有推广应用价值，确保了基层食品的安全，从而提高人们的健康水平,将产生巨大的社会效益和经济效益。