不同提取液对牛至粉中香芹酚和麝香草酚提取效果分析

马建民 段素云 刘 莹 郭 彤

北京农业职业学院，北京102400

牛至（Origanum vulgareL.）为唇形科牛至属多年生草本植物，我国主要分布西北、东北、江西、安徽、湖北、河南等地，本品性凉、味辛、无毒，具有清热解表、利水消肿的功效，主治中暑、感冒、头痛身痛、急性胃肠炎、腹痛吐泻、水肿等症[1]。药理研究表明，牛至精油具有抗菌、抗氧化[2]、增强免疫力作用，是牛至产生药效的主要活性部位，其主要成分为香芹酚和麝香草酚。牛至精油的提取方法主要有有机溶剂提取、水蒸气提取和超临界流体萃取[3]等方法。牛至精油不溶于水、易挥发，可应用环糊精、羧甲基纤维素、海藻钠等辅料进行包膜制成牛至精油预混剂进行使用[4-6]，通过包膜技术减少精油的挥发并增加其溶解性。刘元元等[7]使用5%牛至香酚预混剂，添加量为15 mg/kg，饲料中牛至香酚含量为0.75 mg/kg，促进肉鸡生产性能。彭青云等[8]使用至多兴牛至油添加剂，其香芹酚和麝香草酚含量分别为2.2%和1.1%，添加量为300 mg/kg，饲料中总酚含量为9.9 mg/kg，能改善肉鸡的生产性能和屠宰性能并提高免疫器官指数。郝丹丹等[9]使用购自美国Sigma-Aldrich 公司牛至油，其中香芹酚7.3%、麝香草酚0.18%，最佳添加量为50 mg/kg，饲料中总酚含量为3.74 mg/kg，提高蛋鸡的生产性能和免疫功能。市售牛至精油产品均以香芹酚和麝香草酚作为质量控制指标，当家禽饲料中总酚浓度为0.75~9.90 mg/kg时，可提高家禽的生产性能。牛至其他部位的药效也有报道，早克然·司马义等[10]发现牛至水提取物具有抗炎、止咳及抗自由基作用。李定刚等[11]对不同工艺来源的牛至提取物对小鼠大肠杆菌的防治作用的研究表明，牛至精油与牛至水提物混合使用防治效果最佳。

由于精油的化学性质，牛至的水提液中精油成分含量极低，而牛至精油的单独提取相对复杂，提取后需进行包膜使用，且损失了牛至水提液中部分抗炎、抗氧化成分。本试验在纯化水中添加食品级助溶剂丙二醇或环糊精对牛至进行提取，以乙腈提取作为阳性对比，纯化水提取作为阴性对比，通过高效液相色谱测定提取液中精油成分香芹酚和麝香草酚含量，评价丙二醇、环糊精对牛至精油成分辅助提取作用，为牛至产品开发提供新的提取方法。

1 材料与方法

1.1 试 剂

牛至购自玉林市玉州区菩提药源食品经营部；丙二醇、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精（食品级）购自九州食品配料商城；香芹酚、麝香草酚（＞99.0%）购自macklin 公司；乙腈（为色谱纯）购自Fisher Scientific 公司。

1% β-环糊精溶液：精密称取β-环糊精10.00 g，加蒸馏水1 000 mL 溶解；1%羟丙基-β-环糊精溶液：精密称取羟丙基-β-环糊精10.00 g，加蒸馏水1 000 mL 溶解；10%丙二醇溶液：精密称取丙二醇100 g，加蒸馏水溶解定容至1 000 mL；标准储备液：分别精密称取香芹酚和麝香草酚对照品0.0250 g，用乙腈定容至25 mL，制得终浓度为1 mg/mL 的2种标准储备液。混合标准工作液：取以上2 种标准储备液，用乙腈-水（40∶60）稀释制备1、5、10、20、50 mg/L 5 个系列质量浓度的混合标准工作液，存放于4 ℃冰箱。

1.2 仪 器

电子分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司SQP）、昆山KQ-500DV 超声清洗机、GT10-1型高速离心机（北京时代北利离心机有限公司）、震荡器（IKA）、高效液相色谱仪（岛津LC-16AT）。

1.3 提取方法

牛至粉碎后，过0.15 mm 筛，精确称取3 份牛至粉末0.200 0 g，置10 mL 离心管中，分别加入5 mL提取液，密封，40 ℃超声40 min，6 000 r/min 离心10 min，上清液即为牛至提取液。

1.4 色谱方法

色谱柱InertSustain C18（150 mm×2.1 mm，3 μm）；紫外检测波长276 nm；流动相为乙腈-水（40∶60）；柱温：50 ℃；流速0.4 mL/min；混合标准工作液依次进样10 μL。将测得香芹酚和麝香草酚的色谱峰面积（A）和相对应的浓度（C）做直线回归，求得标准曲线回归方程的线性范围和相关系数。

1.5 提取液中香芹酚和麝香草酚检测

取1.3 上清液过微孔滤膜，量取滤液0.6 mL，加入乙腈0.4 mL，涡动5 min，10 000 r/min 离心10 min，取上清液过微孔滤膜，滤液上机检测，进样10 μL。按峰面积标准曲线法计算提取液中香芹酚和麝香草酚含量。

1.6 数据处理

试验数据采用SPSS 19.0 统计软件进行方差分析，极显著水平为P＜0.01。试验结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 标准曲线和液相色谱图

混合标准工作液和牛至样品色谱图见图1和图2，香芹酚和麝香草酚基本完全分离，色谱峰形对称。香芹酚和麝香草酚的标准曲线方程和相关系数见表1。

图1 混合标准工作液色谱图

图2 牛至样品色谱图

表1 标准曲线和相关系数

2.2 提取液中香芹酚和麝香草酚含量

由表2可知，不同提取液中香芹酚和麝香草酚含量均差异极显著（P＜0.01）。

表2 不同提取液中香芹酚和麝香草酚含量

3 讨 论

3.1 液相色谱检测

香芹酚与麝香草酚为同分异构体，分离较为困难，其化学名称分别为2-甲基-5-异丙基苯酚和5-甲基-2-异丙基酚，窦茂鑫等[12]使用甲醇-水-冰醋酸（60∶40∶2）为流动相对饲料添加剂中的香芹酚与麝香草酚进行检测分析。孙丽娟等[13]使用乙腈-水（50∶50）为流动相对牛至药材中的香芹酚与麝香草酚进行分析。在文献基础上，本试验采用乙腈-水（40∶60）的流动相对提取液进行分析检测，色谱峰分离完全，出峰时间适宜，相关系数符合要求。可以通过标准曲线法计算提取液中香芹酚和麝香草酚含量，进行比较分析。

3.2 不同提取液比较

牛至中挥发油类成分香芹酚和麝香草酚是其抗菌、抗氧化的主要成分，因此用提取液中香芹酚和麝香草酚含量高低评价提取液的提取效果。香芹酚和麝香草酚结构决定其不易溶于水，易溶于有机溶剂，因此乙腈提取液含量最高分别为15.54 mg/L 和24.61 mg/L，蒸馏水提取液含量最低分别是0.29 mg/L和2.36 mg/L，牛至中香芹酚和麝香草酚含量测定一般使用乙腈进行提取[13]。纯化水中添加环糊精和丙二醇提高香芹酚和麝香草酚的含量，其中1% β-环糊精提取液含量最高分别为13.62 mg/L 和17.10 mg/L，达到乙腈的87.64%和69.45%。环糊精具有“内亲油、外亲水”的空腔结构，提高了牛至精油成分溶解度和溶出速率，进而提高提取率[14]。

牛至粉在蒸馏水中香芹酚和麝香草酚溶出率极低，饲料中直接添加牛至粉的报道较少。1% β-环糊精牛至提取液与饲料进行1∶（3~10）比例拌料使用，饲料中总酚含量可达到3.07~10.24 mg/kg，与市售牛至油预混剂的浓度相当[7-9]。牛至1% β-环糊精提取液制备与提取牛至挥发油再制成牛至油预混剂的工艺相比，具有操作简单、成本低的优点。

4 结 论

牛至β-环糊精提取液显著提高了牛至中香芹酚和麝香草酚溶出度，可直接进行拌料使用，应用于畜牧养殖业。