乳酸片球菌的抑菌能力及其对断奶仔猪肠道菌群及黏膜免疫的影响

周登峰 刘雪连 刘 滢 甘大维*

1.武汉大北农农牧发展有限公司，武汉430000；2.北京市饲料安全生物调控工程技术研究中心，北京100192

新生期和断奶期是限制我国集约化、规模化养猪生产效率的2 个关键环节，改善新生和断奶仔猪肠道健康，避免或减少肠道病原微生物感染是养猪生产中亟待解决的重大课题[1-2]。有报道[3-7]称乳酸片球菌在抑制病原菌生长、改善肠道微生物群落结构、刺激宿主免疫等方面表现出良好的益生性能，但是相比较其他益生菌，该菌在断奶仔猪上的应用报道较少。本试验研究乳酸片球菌SKL-03 的体外抑菌能力及其对断奶仔猪肠道微生物菌群和免疫能力的影响，以期为乳酸片球菌制剂在断奶仔猪生产中的应用提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）菌株。试验用乳酸片球菌SKL-03 分离于健康断奶仔猪粪便；大肠杆菌k88、猪霍乱沙门氏菌ATCC13312、金黄色葡萄球菌ATCC6538 均由饲用微生物工程国家重点实验室保存。乳酸片球菌SKL-03试验品：发酵液和冻干粉（活菌数≥5×108cfu/g）；上清液：发酵液经10 000 r/min，3 min 离心后的上清液；由北京大北农科技集团股份有限公司饲用微生物工程国家重点实验室制备。

2）试验试剂。MRS 培养基（青岛奥博星）、NB 培养基（青岛奥博星）、脱脂乳粉、谷氨酸钠、抗坏血酸、蔗糖、海藻糖（北京绿琪生物科技有限公司）、乳酸、乙酸标准品（sigma 公司）。

1.2 抑菌性能

1）试验设计。发酵液组：乳酸片球菌SKL-03 发酵液（含活菌数5×108cfu/mL）；冻干粉组：乳酸片球菌SKL-03 冻干粉（含活菌数5×108cfu/mL）；上清液组：乳酸片球菌SKL-03 发酵液经10 000 r/min，3 min 离心后的上清液；培养基组：MRS 培养基；冻干保护剂组：冻干保护剂（脱脂乳粉15%、谷氨酸钠1.5%、抗坏血酸1%、蔗糖2%、海藻糖7%）。

2）试验方法。有机酸测定：HPLC 法；流动相：0.05%硫酸溶液；色谱柱：C18 柱；流速：1 mL/min，紫外检测器，210 nm。样品过0.45 μm 的滤膜后，上机检测。

牛津杯法[8]：将已灭菌的LB 琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿15 mL（下层），待其凝固。此外，将融化的培养基冷却到50 ℃左右混入致病菌（大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌）浓度约为1×108cfu/mL，将混有致病菌的培养基5 mL加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。用无菌水将待检样品稀释：乳酸片球菌SKL-03 发酵液稀释成0.1 mL/mL、冻干粉0.1 g/mL、上清液0.1 mL/mL；在培养基表面垂直放上牛津杯，在杯中加入培养基空白及待检样品各150 μL，加满后在37 ℃培养16~18 h；游标卡尺测量抑菌圈大小。

1.3 动物功效试验

1）试验动物与试验设计。将90 头体重、性别比例相近的21日龄杜长大断奶仔猪随机分为4 组，A组：饲喂基础日粮；B 组：饲喂基础日粮+乳酸片球菌SKL-03 菌粉1 kg/t；C 组：饲喂基础日粮+乳酸片球菌SKL-03 上清液1 L/t；D 组：饲喂基础日粮+乳酸片球菌SKL-03 发酵液1 L/t。每组6 个重复，每个重复3 头猪，试验期49 d。

2）试验饲粮及饲养管理。试验基础日粮为玉米-豆粕型日粮，参照NCR（2012）7~11、11~25 kg 阶段猪营养需要配制，基础日粮组成及营养水平见表1。本试验在武汉绿色巨农农牧股份有限公司进行，养殖及防疫程序按猪场规定进行。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

3）样品采集与处理。于试验第49 天结算饲粮，所有猪只禁食12 h。试验第50 天对所有试验猪进行称重并记录，按顺序屠宰。采集十二指肠、空肠黏膜样品和结肠、盲肠食糜样品，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。

4）肠道微生物群落。采用实时荧光定量法[9]测定得到断奶仔猪结肠和盲肠中大肠杆菌、沙门氏菌和乳酸杆菌的数量。

5）免疫功能。十二指肠和空肠黏膜中SigA 的含量采用猪分泌型免疫球蛋白A（SigA）酶联免疫吸附试验试剂盒检测。

1.4 数据分析

使用SPASS 20.0 统计软件进行单因素方差分析，数据以“平均值±标准误差”表示，P＜0.05 为差异显著，0.05≤P＜0.10 为有显著差异趋势。

2 结果与分析

2.1 乳酸片球菌SKL-03 试验品对致病菌的抑制作用

由表2可知，相比于培养基组和冻干保护剂组，不同试验品对致病菌均有显著抑制作用（P＜0.05），乳酸片球菌SKL-03 发酵液组抑菌效果最佳，上清液组次之，冻干粉组抑菌圈直径最小；不同试验品组抑菌圈直径随乳酸和乙酸含量的降低而下降。

表2 乳酸片球菌SKL-03 试验品有机酸含量及对指示菌的抑制效果

2.2 乳酸片球菌SKL-03 对断奶仔猪肠道菌群的影响

由表3可知，与空白组相比，菌粉组、上清液组、发酵液组盲肠中的大肠杆菌和沙门氏菌的数量显著降低（P＜0.05）、乳杆菌数量显著提高（P＜0.05）；菌粉组、上清液组结肠中大肠杆菌数量显著降低（P＜0.05），发酵组差异不显著（P＞0.05）；各组间结肠中乳酸杆菌数量差异不显著（P＞0.05）；菌粉组和发酵液组结肠中沙门氏菌数量显著降低（P＜0.05），上清液无显著差异（P＞0.05）。

表3 乳酸片球菌制剂对70日龄仔猪盲肠和结肠菌群的影响

2.3 乳酸片球菌SKL-03 对断奶仔猪十二指肠和空肠SIgA 的影响

由表4可知，与空白组相比，上清液组、发酵液组十二指肠黏膜中SIgA 含量显著提高（P＜0.05），菌粉组差异不显著（P＞0.05）；菌粉组、上清液组、发酵液组空肠黏膜中SIgA 含量显著提高（P＜0.05），菌粉组对空肠黏膜中SIgA 含量影响最大，显著高于上清液组和发酵液组（P＜0.05）。

表4 乳酸片球菌制剂70日龄仔猪十二指肠和空肠黏膜中SIgA 含量的影响

3 讨 论

3.1 乳酸片球菌SKL-03 对致病菌的抑制作用

研究[10-12]表明，乳酸片球菌产生的有机酸和乳酸片球菌素等能有效抑制致病菌。本试验研究表明，乳酸片球菌SKL-03 菌粉、上清液、发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均有显著的抑菌效果，这与王建设等[13]、Mduduzi[14]、陈亚男等[15]的研究结果相似；在牛津杯法抑菌试验中，发酵液组的抑菌效果最好，其次是上清液组；且抑菌能力与试验品中的有机酸含量有关，试验品种有机酸含量越高，抑菌圈直径越大，表明乳酸片球菌可通过产生有机酸等抑菌物质抑制病原菌的生长。

3.2 乳酸片球菌SKL-03 对断奶仔猪肠道菌群的影响

断奶应激因降低仔猪肠道有益菌数量，增加有害菌数量而危害断奶仔猪的健康[16]。诸多研究[17-20]表明，在断奶仔猪饲粮中添加乳酸菌具有调节肠道微生物群、保持仔猪肠道微生物群稳定的效果。本试验研究表明，与空白组相比，菌粉组、上清液组、发酵液组盲肠中的大肠杆菌和沙门氏菌的数量显著降低（P＜0.05）、乳杆菌数量显著提高（P＜0.05）；菌粉组、上清液组结肠中大肠杆菌数量显著降低（P＜0.05），菌粉组和发酵液组结肠中沙门氏菌数量显著降低（P＜0.05），乳酸杆菌数量差异不显著（P＞0.05），这与学者们[21-24]的研究结果相似；这表明饲粮中添加乳酸片球菌及其代谢产物能够抑制有害菌生长，改善肠道微生态环境。

3.3 乳酸片球菌SKL-03 对断奶仔猪十二指肠和空肠SIgA 的影响

SIgA 具有对机体实现免疫保护的作用[16]，本试验结果表明，饲料中添加乳酸片球菌SKL-03 及其代谢产物可通过提高十二指肠及空肠黏膜中SIgA的含量来对机体实现免疫保护。

4 结 论

本试验条件下，乳酸片球菌SKL-03 菌粉、上清液、发酵液具有抑制病原菌生长的作用，在饲粮中添加上述试验品具有降低肠道致病菌的数量，提高有益菌数量和小肠黏膜免疫功能的效果。