姜黄素衍生物C086通过PI3K-Akt通路诱导肝癌HepG2细胞凋亡

郭登方 王若涛 黄建成 王瑞华 张扬平 张春

(福建医科大学附属宁德市闽东医院 1普外科，福建 宁德 355000；2检验科)

尽管近年来治疗肝细胞癌(HCC)的方法有大幅度改善〔1,2〕，但终末期HCC患者死亡率依然很高，且HCC早期诊断率低，一经发现多已进入HCC终末期，极易扩散，使HCC治愈变得异常艰难〔3〕，因此寻找新的治疗途径变得非常迫切。姜黄素是一种从姜黄根茎中提取的天然化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗纤维化等多种药理作用，且对人体毒性小〔2〕。姜黄素衍生物-4(4-甲基-3氧基苯甲基，C086)是一种新合成的姜黄素衍生物，其生物活性优于姜黄素，具有良好抗突变和抗肿瘤作用〔4〕。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路是一种重要的凋亡抑制通路，在肿瘤细胞的增殖、活化和迁移等方面发挥重要调控作用〔5〕。本研究利用C086处理HCC HepG2细胞，拟观察C086对HCC HepG2细胞凋亡的影响并初步探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 人HepG2细胞系购自美国ATCC，RPMI1640培养基(批号：11875193)、胎牛血清(FBS，批号：10099-145)购自美国Gibco公司；姜黄素C086(批号：20180305，纯度≥98.5%)购自北京索莱宝生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO，批号：ST038)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒(批号：C0009)、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(批号：P0028)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(批号：P0010S)、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(批号：C1062S)购自上海碧云天；鼠源一抗β-actin抗体、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2抗体、 Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体、PI3K抗体、p-PI3K抗体、AKT抗体、p-AKT抗体、细胞色素(Cyt)C抗体，二抗羊抗鼠IgG(批号：B-2752)均购自美国Invitrogen；酶标仪、5%CO2培养箱购自美国Thermo Fisher；流式细胞仪购自美国BD；倒置显微镜购自日本Olympus等。

1.2试验方法

1.2.1MTT法检测HepG2细胞增殖 取培养至对数生长期的HepG2细胞接种于96孔细胞板中继续培养，每孔接种细胞数量约0.5×105个，每孔体积200 μl；细胞完全贴壁后更换培养基并加入不同浓度C086(0、10、20、40 μmol/L)分别培养24 h、48 h、72 h，每组6个重复。培养结束前4 h每孔加入MTT(5 g/L)20 μl，培养结束后弃去上清液，每孔加200 μl DMSO，轻微震荡10 min，待MTT沉淀物彻底溶解后上酶标仪，检测各孔570 nm吸光度(A)值，并记录结果。细胞增殖率=(C086 A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。

1.2.2流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡 检测HepG2细胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI双染色法，取生长至对数期的HepG2细胞约2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中，待细胞汇合至80%时，C086处理及对照组设置同上。培养48 h后每孔500 μl结合缓冲液重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC混匀后，再加入5 μl PI，避光轻轻振荡混匀，室温放置15 min。同时设置阴性对照(无Annexin V-FITC和PI)，放入流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡率。

1.2.3流式细胞仪检测HepG2细胞线粒体膜电位 取生长至对数期的HepG2细胞按5×105个/ml接种于6孔细胞培养板中，添加培养基3 ml、C086(0、10、20、40 μmol/L)各100 μl培养48 h，待细胞汇合至90%，重悬细胞，1 000 r/min 离心5 min，弃上清；预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤重悬细胞，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入1 mmol/L罗丹明123，37℃孵育15 min，PBS洗涤2次，重悬细胞，放置流式细胞仪FL1通道检测。

1.2.4Western印迹检测HepG2细胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2、Cyt C蛋白表达 收集不同浓度C086处理过的细胞，用预冷PBS洗涤后，严格按照蛋白提取试剂盒操作说明提取细胞总蛋白，蛋白浓度采用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定，提取的蛋白置于-80℃保存备用。加入1/5体积6×SDS上样缓冲液，95℃ 5 min，冷却离心后置于-20℃保存备用。取 80 μg蛋白样品，以β-actin做为内参，6% SDS-PAGE 电泳。用湿转法将胶上蛋白转移至NC膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释，加一抗(PI3K、p-PI3K抗体1∶500；AKT、p-AKT抗体1∶1 000；Bcl-2抗体1∶500；Bax抗体1∶500；Cyt C抗体1∶500；β-actin抗体1∶500)4℃孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜3次，每次20 min，用适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释辣根过氧化物酶标记的二抗IgG(1∶5 000)室温孵育 1.5 h，按上述方法洗膜，用化学发光试剂(ECL)显色，数字化多功能图像增强化学发光系统曝片，观察结果并进行分析。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0统计软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1C086对HepG2细胞增殖的作用 MTT结果显示，与0 μmol/L 组比较，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086处理组HepG2细胞增殖抑制率显著增加(P<0.05)；与10 μmol/L 组比较，20 μmol/L、40 μmol/L C086处理组HepG2细胞增殖抑制率显著增加(P<0.05)；与20 μmol/L组比较，40 μmol/L C086处理组HepG2细胞增殖抑制率显著增加(P<0.05)；且随着作用时间的延长HepG2细胞增殖抑制率显著增加，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度C086对HepG2细胞增殖抑制率的影响

2.2C086对HepG2细胞凋亡的影响 流式细胞仪分析结果显示，与0 μmol/L 组比较，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086组HepG2细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与10 μmol/L组比较，20 μmol/L、40 μmol/L C086组HepG2细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与20 μmol/L组比较，40 μmol/L C086 组HCC HepG2细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见图1，表2。

图1 流式细胞仪检测C086对HepG2细胞凋亡的影响

表2 不同浓度C086对HepG2细胞凋亡及细胞膜电位的影响

2.3C086对HCC HepG2细胞线粒体膜电位的影响 与0 μmol/L组比较，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086 组HepG2细胞线粒体膜电位均显著降低(均P<0.05)；与10 μmol/L组比较，20 μmol/L、40 μmol/L C086 组HepG2细胞线粒体膜电位均显著降低(均P<0.05)；与20 μmol/L组比较，40 μmol/L C086 组HepG2细胞线粒体膜电位显著降低(P<0.05)。见表2。

2.4C086对Bax、Bcl-2、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3及Cyt C蛋白表达的影响 与0 μmol/L组比较，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086 组Bcl-2蛋白水平均显著下调，caspase-3、Bax、Cyt C蛋白水平均显著上调(P<0.05)；与10 μmol/L组比较，20 μmol/L、40 μmol/L C086 组Bcl-2蛋白水平均显著下调，caspase-3、Bax、Cyt C蛋白水平均显著上调(均P<0.05)；与20 μmol/L比较，40 μmol/L C086组Bcl-2蛋白水平均显著下调，caspase-3、Bax、Cyt C蛋白水平均显著上调(均P<0.05)。见图2、表3。

1～4：0 μmol/L组、10 μmol/L组、20 μmol/L组、40 μmol/L组、下图同图2 Western印迹检测caspase-3、Bax、Cyt C和Bcl-2蛋白表达

表3 C086对HepG2细胞caspase-3、Bax、Cyt C和Bcl-2蛋白表达的影响

2.5C086对PI3K、AKT及p-AKT蛋白表达的影响 与0 μmol/L组比较，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086组p-PI3K及p-AKT蛋白水平均显著下调(均P<0.05)；与10 μmol/L组比较，20 μmol/L、40 μmol/L C086 组p-PI3K及p-AKT蛋白水平均显著下调(均P<0.05)；与20 μmol/L比较，40 μmol/L C086 组p-PI3K及p-AKT蛋白水平显著下调(P<0.05)；0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086各组PI3K、AKT蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3，表4。

图3 Western印迹检测PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白表达表达

表4 C086对HepG2细胞PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白表达的影响

3 讨 论

HCC是消化系统常见恶性肿瘤之一，分为原发性和继发性两大类，其中原发性肝癌在我国发病率极高，死亡率也高，严重危协人类健康〔6〕。HCC的发生发展过程极其复杂，目前治疗方式主要包括手术切除、放化疗及肝脏移植等，但疗效都不理想，因此寻找新的治疗方法和途径成为目前迫切需要解决的问题〔7〕。许多研究报道，一些植物提取物，比如姜黄素〔8〕、白芦藜醇〔9〕、绿茶〔10〕等药理作用广泛且对人体毒性低，在癌症及肿瘤预防和治疗过程中起到非常积极的作用，但其作用机制尚不完全清楚。

姜黄素是一种多酚类植物提取物，具有抗突变和抑制肿瘤作用，研究发现，它在多种肿瘤细胞、肿瘤干细胞及临床实体肿瘤中均具有抗肿瘤活性〔11〕，应用前景广阔。C086是以姜黄素为先导新合成的一种姜黄素衍生物，王晓露等〔4〕研究发现C086可通过抑制癌基因C-myc和STAT-3蛋白表达，抑制胰腺癌细胞Panc-1的侵袭和转移。C086在肝癌细胞中的作用尚鲜有报道。本研究结果发现不同浓度C086处理HCC HepG2细胞，可浓度依赖性抑制HCC HepG2细胞增殖、促进HCC HepG2细胞凋亡，但具体机制不清楚。

Da等〔12〕研究发现，线粒体在细胞凋亡过程中起非常关键作用，线粒体膜电位与线粒体膜通透性呈负相关，线粒体膜通透性取决于线粒体外膜与内膜间隙由多种蛋白组成的线粒体膜通透性转运孔(MPTP)的开放〔13〕。线粒体间隙存在CytC、钙离子、细胞促凋亡因子等，MPTP开放导致线粒体膜电位改变，使线粒体内部Cyt C和促凋亡因子等外流，进而激活细胞凋亡通路，增加促凋亡蛋白的表达〔14〕。Bcl-2的生理功能是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命〔15〕，它在不同细胞类型中可定位于内质网、线粒体和核膜上，通过阻止线粒体Cyt C的释放发挥抗凋亡作用〔16〕。caspase-3在细胞凋亡中起不可替代的作用，是一种凋亡执行蛋白；Bax是人体主要凋亡基因，属于Bcl-2家族，与Bcl-2是拮抗关系。有研究发现Bax/Bcl-2 两蛋白之间的比例关系是决定细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素〔10〕。本研究结果发现，C086呈浓度依赖地降低HCC HepG2细胞线粒体膜电位，下调Bcl-2蛋白表达，上调caspase-3、Bax和Cyt C蛋白表达，提示C086可增加线粒体通透性，使线粒体膜电位改变，Cyt C外流，上调caspase-3、Bax和阻止Bcl-2蛋白表达。

PI3K-AKT通路广泛存在于细胞中，参与细胞的增殖分化过程〔17〕。有研究发现，PI3K-AKT通路在细胞凋亡过程中起到非常重要的作用。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可使自身和其他多种蛋白磷酸化发挥生物学活性，AKT在PI3K-AKT通路中发挥非常关键作用，AKT活性升高可以抑制细胞凋亡〔12〕。PI3K同时具有脂类激酶活性和蛋白激酶活性，在被激活可使细胞膜上的肌醇发生磷酸化后变成第二信使，与其下游效应分子AKT结合后使AKT发生磷酸化变成p-AKT，进而可编码下游凋亡蛋白caspase-3、Bax、Cyt C和Bcl-2等〔18〕。本研究结果提示C086可能通过抑制PI3K-AKT通路抑制HepG2细胞增殖、促进HepG2细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。Zhou等〔19〕研究指出，猴头菌素可以促进MPTP开放，使Cyt C释放增加，进而激活PI3K-Akt通路抑制HCC细胞增殖、转移和侵袭，促进HCC细胞凋亡；Liu等〔20〕研究发现，瑞舒伐他汀可通过诱导PI3K-AKT和GSK-3β发生磷酸化，进而促进MPTP开放，防止心肌缺血-再灌注损伤。因此本研究推测C086可能通过PI3K-AKT通路促进MPTP开放，增加线粒体膜通透性，导致HepG2细胞中caspase-3、Cyt C、Bax蛋白增加和Bcl-2蛋白减少，抑制HepG2细胞增殖、促进其凋亡。