左卡尼汀对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的保护作用

马玉杰 朴尚国 李慧瑛 姜玉姬 玄美英 郑海兰 金吉哲 金英顺 李灿

(延边大学附属医院 1肾病科，吉林 延吉 133000； 2体检科)

根据美国肾脏数据服务年度报告，慢性肾脏病(CKD)在普通人群中的总体患病率已超过14%，并且每年呈上升趋势〔1〕。CKD进展为终末期肾病(ESRD)需要昂贵的肾脏替代治疗，因此，减缓这种临床症候群不仅可以提高CKD患者的生活质量，而且可减轻社会经济负担。肾小管间质纤维化(TIF)是CKD的最终病理学特征。单侧输尿管梗阻(UUO)是TIF的代表性动物模型，其表现为肾间质炎症反应、肾小管扩张和萎缩及 TIF 的形成，其分子机制极其复杂，包括炎性介质、致纤因子、氧化应激、程序性细胞死亡等因素的参与〔2,3〕。

左卡尼汀(LC)又称左旋肉毒碱，是一种季铵化合物，其主要功能是促进脂类代谢。作为脂肪酸β-氧化的辅助因子，既能将长链脂肪酸带进线粒体基质，促进其氧化分解，为细胞提供能量，又能将线粒体内产生的短链脂酰基输出。另外，LC 有助于维持线粒体内脂肪酸β-氧化,抑制自由基的生成，并通过氧化膜脂的更新保护组织免受损伤〔4〕。因此，LC具有非脂类代谢依赖的抗氧化作用。研究表明，LC对肾缺血再灌注〔5〕、造影剂肾病〔6〕、高血压相关性肾纤维化〔7〕、顺铂肾病〔8〕和肾病综合征〔9〕具有保护作用。类似的保护作用亦可在糖尿病足细胞损伤〔10〕和心肌梗死〔11〕中观察到。本实验探讨LC对UUO所致大鼠TIF的保护作用。

1 材料和方法

1.1建立动物模型与药物治疗 38只雄性SD大鼠购自延边大学动物实验室，体重220～240 g。经1 w的适应期后，大鼠在相应的代谢笼中进行12 h的人工光暗循环，允许自由进食标准的饲料和饮用水。 体重匹配的大鼠随机分为假手术组(n=6)、UUO7组(n=8)、 UUO7+LC组(n=8)、UUO14组(n=8)和UUO14+LC组(n=8)。在苯巴比妥40 mg/(kg·d)麻醉下，UUO组行侧后腹切口游离左侧输尿管并结扎，假手术组仅游离输尿管后缝合皮肤。UUO组给予腹腔注射LC 〔200 mg/(kg·d)，Sigma Aldrich C0158〕，而假手术组给予等量生理盐水，分别于第7天、第14天处死大鼠。收集尿液和肾组织标本以备进一步检测。该动物实验获得延边大学附属医院动物伦理委员会批准。

1.2实验用抗体 采用免疫组化和Western印迹的抗体如下：转化生长因子(TGF)-β1(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)；结缔组织生长因子(CTGF)(#ab125943)、基质金属蛋白酶(MMP)-2(#ab38929)、 单核巨噬细胞抗原(ED)-1 (Serotec Inc.,UK),骨桥蛋白(OPN,#ab8448,Abcam,UK)、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1 (Santa Cruz Biotechnoogy,Inc.)、Toll样受体(TLR)-2 (Santa Cruz Biotechnoogy,Inc.)、超氧化物歧化酶(SOD)2(#ab13534,Abcam,Cam-bridge,MA),烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAPDH)氧化酶(NOX)-2 (#ab31092,Abcam,UK)、 线粒体外膜易位酶(TOMM)20 (#ab186734,Abcam,UK),NADH脱氢酶(辅酶Q)1a复合体亚基(NDUFA)10 (#ab96464,Abcam,UK),琥珀酸脱氢酶黄素蛋白(SDHA，#ab66484,Abcam,UK),线粒体动力样蛋白(DLP1/Drp1，BD Transduction Laboratories,Lexington,KY),视神经萎缩蛋白(OPA)1 (#ab90857,Abcam,UK)、β-actin (#ab8226,Abcam,UK)。

1.3尿8-羟脱氧鸟苷(8-OHdG)水平测定 根据试剂盒操作步骤用酶联竞争免疫吸附法测定尿 8-OHdG DNA加合物水平(Cell Biolabs，San Diego，CA，USA)。

1.4肾脏病理 获取的肾组织由过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛液(PLP)固定，石蜡包埋后切片，行trichrome和HE染色，采用彩色图像自动分析仪(Polygon program，TDI Scope Eye Version 3.5 for Windows；Olympus，Japan)高倍镜视野下分析TIF程度。每个标本至少观察20个非重叠区域取平均数。

1.5免疫组织化学染色 免疫组化步骤简述如下：石蜡包埋切片置二甲苯脱蜡，梯度酒精中脱水，37℃ 下 0.3% 过氧化氢/甲醛 30 min处理后，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗3次。置微波炉中加热行微波炉抗原修复(98℃ 5 min)。室温下非免疫性血清封闭液20 min。在4℃下滴加抗ED-1 单克隆抗体和抗OPN孵育12～16 h。PBS洗3次后滴加Ⅱ抗,温孵育2 h。以二氨基联苯胺(DAB)为底物显色，呈棕黄色为止。自来水流水洗涤，复染苏木素，常规树脂封片。染色程度用数字化显微镜分析仪(TDI Scope EyeTMVersion 3.0 for Windows，Olympus，日本)，Polygon 程序算出每0.5 mm2染色面积的百分比。

1.6电镜观察 肾皮质组织在二甲胂酸钠溶液配制的戊二醛固定48 h，磷酸缓冲液冲洗3次，1%锇酸固定2 h，双蒸水冲洗，常规脱水、环氧树脂定向包埋，LKB-V型超薄切片机先行半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜定位后行超薄切片，厚50～70 nm，醋酸铀、枸橼酸铅双染色，1200EX(JEOL)型透射电镜观察。

1.7Western印迹 肾组织用蛋白裂解液制成匀浆，室温下离心后取上清液测定蛋白浓度，20 μg标本在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转膜2 h后，4℃下置Ⅰ抗于非脂牛乳中以1∶1 000浓度孵育12～16 h，缓冲液洗3次后加辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG(Amersham)1 h缓冲液洗3次，增强发光(ECLTM，Amersham)和曝光。以对照组为标准(100%)测定条带的光密度，以β-actin为内参。

1.8统计学处理 采用 SPSS21.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Bonferroni post hoc校正。

2 结 果

2.1LC对UUO所致TIF的作用 肉眼可见UUO导致肾脏体积增大、肾盂扩张积水、皮质变薄，这种改变在UUO第14 天尤为明显。Trichrome染色、HE染色提示主要病变位于肾小管间质，表现为小管基底膜增厚、肾小管坏死、空泡形成、炎性细胞浸润、肾小管萎缩、间质纤维化(图1)；电镜检查清楚可见萎缩的、空泡变性的小管和束状胶原纤维在肾间质沉积(图2)。定量计分系统分析表明LC明显减少TIF程度呈时间依赖性。Western印迹结果显示LC抑制UUO所致的TGF-β1、CTGF、MMP-2的高表达。见表1。

A：UUO肉眼观察;B：Trichrome 染色(×200)；C：HE染色(×200)图1 各组肾脏肉眼观察和病理组织变化

图2 电镜观察各组肾小管损伤特征及Western印迹法分析致纤因子蛋白的表达

表1 各组TIF半定量分析及TGF-β1、CTGF、MMP2 Western印迹表达量

2.2LC对UUO所致炎性反应的作用 免疫组化结果表明UUO导致大量的ED-1阳性细胞在肾小管间质浸润和炎性介质OPN高表达(表2和图3)。LC治疗分别在UUO第7、14天显著减少ED-1阳性细胞数和OPN的免疫活性。另外，Western印迹结果显示LC明显下调MCP-1、TLR-2的表达且呈时间依赖性 (表2和图4)。以上结果表明LC治疗对UUO所致的肾损伤具有抗炎作用。

表2 各组免疫组化阳性细胞半定量分析及MCP-1、TLR-2 Western印迹表达量

图3 各组ED-1和OPN免疫组化(×200)

图4 电镜观察UUO7组及UUO7+LC组中炎性细胞浸润

2.3LC对UUO所致氧化应激的作用 8-OHdG在大鼠尿中的含量随UUO时间递增，LC治疗明显减少尿8-OHdG的含量。 Western印迹结果表明LC通过增加 SOD2的表达和减少NOX-2的表达，保持氧化酶和抗氧化酶的平衡(图5，表3)。

1～5：假手术组,UUO7组,UUO7+LC组,UUO14组,UUO14+LC组，图7同图5 各组氧化应激相关指标变化

表3 各组24 h尿中8-OHdG排泄量及SOD2、NOX-2 Western印迹表达量

2.4LC对UUO所致染色体失功的作用 透射电镜表明，UUO所致线粒体结构损伤表现为线粒体嵴肿胀、碎片(分裂)、 融合，造成线粒体体积变少和数量减少(图6)。通过定量分析系统，LC保持了线粒体结构的数量和大小的完整性。Western印迹分析表明，与假手术组相比，UUO组 TOMM20、 NDUFA10、SDHA、OPA1的表达明显受到抑制，反之，Drp1表达增加，LC治疗逆转了上述指标(图7，表4)。

A：正常线粒体(×20 000)；B：UUO组肾组织线粒体数量减少(×20 000)；C： UUO组线粒体空泡变性(箭头，×20 000)；D：UUO组自噬体形成(箭头，×20 000)；E：UUO组线粒体分为两个子细胞器(分裂，箭头，×30 000)；F：UUO组线粒体融合(圆形，×40 000)图6 电镜观察各组肾组织线粒体形态典型特征

OPA1 L：长链OPA1；OPA1 S：短链OPA1图7 Western印迹分析线粒体功能相关蛋白的表达

表4 各组线粒体大小和数量半定量分析及线粒体功能相关因子Western印迹表达量

3 讨 论

大量研究表明，炎症在肾损伤中起着关键作用，因为它先于肾纤维化形成。炎症反应是对损伤性刺激的一种保护性本能反应。然而持续的炎症可刺激肾小管上皮细胞、肌成纤维细胞、巨噬细胞等分泌炎性介质和致纤因子，导致细胞外基质蛋白在肾小管间质沉积，形成不可逆的肾纤维化。其中，巨噬细胞是纤维化相关趋化因子和细胞因子如MCP-1、趋化因子受体、黏附分子和TGF-β1的主要来源〔12〕。而趋化因子和 TGF-β1反过来招募炎症细胞聚集，形成恶性循环。本研究发现LC减少了肾小管间质ED-1阳性细胞数，同时抑制了炎症介质OPN、MCP-1和TLR-2及TGF-β1和CTGF的高表达，降低了UUO所致MMP-2蛋白表达，从而改善了TIF程度。因此，LC在UUO大鼠模型中具有抗炎和抗纤维化作用。

LC对UUO大鼠模型发挥抗炎和抗纤维化作用的过程可能有多因素参与共同完成，其中氧化应激是决定性因素。UUO引起的缺血缺氧而引发氧化应激损伤，最终导致肾脏炎症和纤维化形成。Kim等〔13〕报道甲硫氨酸硫氧化物还原酶A缺乏可通过增加胶原沉积而加重UUO诱导的肾纤维化进展，而这种肾纤维化在可溶性环氧化物水解酶基因敲除小鼠中或通过使用抗氧化剂维生素E可以得到缓解，进一步确认了氧化应激在UUO所致肾纤维化中的作用。LC直接抑制还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶诱导的大鼠肾上皮细胞(NRK-52E)和HK-2细胞内活性氧的生成。Xiang等〔14〕报道LC降低肾内8-OHdG的表达，从而防治环孢素A诱导的肾损伤。 本实验观察到LC不仅增加了UUO组抗氧化酶蛋白的表达，而且减少了氧化酶蛋白的表达及尿8-OHdG水平，促使抗氧化酶蛋白和氧化酶蛋白平衡，以达到氧化应激最小化。这与之前在肝脏、心脏、大脑和糖尿病中的报道〔15～18〕一致，表明LC具有强大的抗氧化能力。

LC还可以通过保护线粒体网络的完整性来减轻肾脏炎症和纤维化。线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞制造能量的主要结构，更是细胞进行有氧呼吸的主要场所，在维持细胞能量稳态中起关键作用，同时也是活性氧的主要来源。在病理条件下，线粒体功能障碍可导致炎症、氧化应激损伤和随之而来的细胞程序性死亡。因此，氧化应激和线粒体异常是相互作用相互关联的。研究表明〔17〕，LC可改善老年大鼠脑线粒体生物合成和线粒体动力学，并保护高热量饮食加链脲佐菌素诱导的2型糖尿病小鼠线粒体功能。本研究结果表明，UUO 7 d破坏了线粒体的正常结构，造成线粒体功能紊乱，尤其是在UUO 14 d。LC治疗明显维护了线粒体体积、保存了线粒体的绝对数量。Western印迹结果提示，LC调节了线粒体相关基因蛋白的表达。综上，LC发挥抗炎、抗纤维化作用与减少氧化应激、保护线粒体网络完整性密切相关。

在临床实践中，使用LC通常用于治疗由遗传疾病、慢性血液透析或慢性心力衰竭引起的肉碱缺乏症。 由于LC具有抗氧化活性，它可能广泛地应用于多种疾病。如使用LC可以改善血液透析患者的心血管损伤及心绞痛、左心室扩大或扩张和心律失常的心肌梗死。此外，对脂肪肝和非酒精性肝病也有良好的改善作用。LC对UUO所致肾间质纤维化具有抗炎、抗纤维化作用，抑制氧化应激和保护线粒体是其发挥肾脏保护作用的分子机制。