靶向抑制LncRNA-ATB对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响

吕静 刘超 李可佳 周晓慧 薛晶 王明娟

(承德医学院 1基础医学院,河北 承德 067000;2附属医院心脏内科;3形态学实验中心)

子宫内膜癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，近年来发病率呈上升趋势，且晚期、复发性子宫内膜癌预后极差，临床治疗十分困难〔1，2〕。因此寻找特异性强的分子标志物及子宫内膜癌致病机制的确切靶点用于子宫内膜癌的早期诊断和治疗尤为重要。长链非编码RNAs(LncRNAs)是一类不具有编码蛋白质功能，核苷酸长度>200 nt的RNA分子，在多种肿瘤的发生发展中发挥至关重要的作用，是潜在的肿瘤标志物及治疗靶点〔1，3，4〕。LncRNA-ATB位于人类第13、14、22号染色体上，研究发现在多种肿瘤中异常表达，如肝细胞癌〔5〕、肺小细胞癌〔6〕、结肠癌〔7〕、乳腺癌〔8〕等。但其对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响尚未见报道。本研究通过靶向抑制子宫内膜癌细胞内LncRNA-ATB的表达，观察LncRNA-ATB对子宫内膜癌细胞增殖能力、凋亡水平、迁移和侵袭能力的影响，以期为寻找早期诊断子宫内膜癌的分子标志物及其治疗的确切靶点提供有价值的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 人子宫内膜癌Ishikawa细胞株购自南京凯基生物公司，人子宫内膜癌HEC-1-A细胞株购自北京北纳联创公司，RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，McCoy 5A培养基购自中科迈晨，TRIzol试剂、Lipofectamine2000、荧光定量PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司，二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶-二氨基联苯胺(EDTA)消化液(0.25%)、胰蛋白酶(0.25%，不含EDTA和酚红)，磷酸盐缓冲液(PBS)购自Solarbio公司，FITC标记的Annexin-V及碘化丙啶(PI)试剂购自美国BD公司，Transwell小室购自美国Corning公司，LncRNA-ATB-SiRNA及LncRNA-ATB-NC由上海吉玛公司设计并合成，RNA逆转录和实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.2实验分组 LncRNA-ATB干扰组(ISK-siRNA组和HEC-siRNA组)：转染LncRNA-ATBsiRNA；阴性对照组(ISK-NC组和HEC-NC组)：转染LncRNA-ATB-NC；空白对照组(ISK组和HEC组)：仅以10%FBS培养基培养细胞。

1.3转染 将Ishikawa细胞、HEC-1-A细胞分别常规培养于含10%FBS的培养基中，取对数生长期的细胞进行实验。将细胞密度调整为5×105/ml，将Ishikawa细胞、HEC-1-A细胞分别接种于6孔板，接种24 h后，细胞密度达到60%～70%，按照实验分组进行转染，转染试剂的配制参照Lipofectamie2000说明书。转染5 h后更换为含10%FBS的完全培养基继续培养。

1.4qRT-PCR检测细胞中LncRNA-ATB mRNA的表达水平 转染24 h后，TRIzol法分别提取细胞总RNA，逆转录成cDNA作为模板。LncRNA-ATB引物上游序列：5′-TCCTGGCTGTGGACTGGCTA-3′，下游序列：5′-TGTATCAACTCAGGCTCTGTGCTTC-3′，扩增产物长度：133 bp。内参GAPDH引物上游序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，扩增产物长度：138 bp。反应条件：预变性95℃、15 min，变性95℃、10 s，退火60℃、30 s，40个循环，重复3次。用2-△△Ct方法计算目的基因表达量。

1.5MTT法检测细胞增殖能力 取对数生长期细胞，调整细胞密度为5×105/ml，接种于96孔板，24 h后进行转染，每组设置3个复孔，并设置调零孔，边缘孔加入PBS。分别于转染后24、48、72 h每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育4 h，终止培养，吸除孔内培养液，每孔加入150 μl DMSO，震荡溶解，酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值。

1.6Annexin V-FITC/PI细胞凋亡率检测 收集转染后48 h各组细胞，PBS清洗2遍，胰酶消化(无EDTA)，1 000 r/min离心5 min，弃培养液，加入2 ml PBS轻轻吹打，混匀，过筛网入另一组流式管，1 000 r/min离心5 min，弃PBS，加入100 μl缓冲液、5 μl FITC、5 μl PI轻混，室温避光反应15 min，再加入400 μl缓冲液，进行流式细胞仪检测。

1.7Transwell小室检测迁移能力 收集转染24 h的各组细胞，PBS冲洗2遍，胰酶消化，培养液终止消化，离心，弃培养液，PBS清洗2遍，基培重悬，调整细胞密度为5×105/ml。每孔上室加入200 μl单细胞悬液，下室加入600 μl含20%FBS培养液。将小室放入37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h。取出小室，PBS冲洗2遍，4℃预冷的甲醛固定30 min，风干，0.1%结晶紫染色15 min，棉签擦去上层未迁移细胞，倒置显微镜下随机观察5个视野细胞数量计数，取平均值，实验重复3次。

1.8Transwell小室检测侵袭能力 将预置胶的Transwell小室从-20℃冰箱中取出，于上室和下室中分别加入500 μl基培，置于37℃、5%CO2培养箱中水化2 h。加入细胞悬液后在37℃、5%CO2培养箱中孵育30 h，其余实验方法同迁移实验。

1.9统计学分析 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1qRT-PCR检测转染24 h后各组细胞中LncRNA-ATB mRNA的表达水平 Ishikawa中ISK-siRNA组LncRNA-ATB mRNA相对表达水平(0.167±0.050)显著低于ISK-NC组(0.923±0.066)和ISK组(1.000±0.000，P<0.05)，ISK-NC组和ISK组比较差异无统计学意义(P>0.05)；HEC-1-A细胞中HEC-siRNA组LncRNA-ATB mRNA相对表达水平(0.035±0.012)低于HEC-NC组和HEC组(0.968±0.056，1.000±0.000)，差异有统计学意义(P<0.05)，HEC-NC组和HEC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2MTT检测转染24、48、72 h后各组细胞增殖活性比较 ISK-siRNA组48、72 h OD值显著低于ISK-NC组(P<0.05)，见图1； HEC-siRNA组24、48 h OD值显著低于HEC-NC组(P<0.05)，见图2。

与ISK-NC组比较：1)P<0.05图1 LncRNA-ATB对Ishikawa细胞增殖的影响

与HEC-siRNA组比较：1)P<0.05图2 LncRNA-ATB对HEC-1-A细胞增殖的影响

2.3各组细胞凋亡率比较 ISK-siRNA组细胞总凋亡率为(21.990±1.265)%，ISK-NC组为(6.870±1.128)%，差异有统计学意义(P<0.05)。HEC-siRNA组细胞总凋亡率为(18.027±1.585)%，HEC-NC组为(9.090±1.896)%，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3，图4。

图3 LncRNA-ATB对Ishikawa细胞凋亡的影响

图4 LncRNA-ATB对HEC-1-A细胞凋亡的影响

2.4各组细胞迁移能力比较 迁移实验结果显示，ISK-siRNA组细胞穿膜细胞数〔(19.1±3.0)个〕少于ISK-NC组〔(34.4±2.4)个〕，差异有统计学意义(P<0.05)；HEC-siRNA组细胞穿膜细胞数〔(22.8±2.2)个〕少于HEC-NC组〔(45.9±2.8)个〕，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5，图6。

图5 LncRNA-ATB对Ishikawa细胞迁移的影响(0.1%结晶紫染色，×200)

2.5各组细胞侵袭能力比较 侵袭实验结果显示，ISK-siRNA组细胞穿膜细胞数〔(15.8±2.2)个〕少于ISK-NC组〔(31.0±3.8)个〕，差异有统计学意义(P<0.05)，见图7；HEC-siRNA组细胞穿膜细胞数〔(20.5±2.3)个〕少于HEC-NC组〔(40.7±3.1)个〕，差异有统计学意义(P<0.05)，见图8。

图8 LncRNA-ATB对HEC-1-A细胞侵袭的影响(0.1%结晶紫染色，×200)

3 讨 论

近来研究表明，LncRNA在肿瘤的发生发展过程中发挥促癌或抑癌的作用，参与了细胞增殖、凋亡调控及肿瘤浸润与转移等〔9〕。LncRNA-ATB全长2 446 nt，位于人14号染色体上，相关研究表明，LncRNA-ATB在多种肿瘤细胞中异常表达，并调控肿瘤细胞的增殖、凋亡及迁移、侵袭等生物学特性〔10，11〕。Shi等〔8〕研究发现，下调LncRNA-ATB的表达可抑制曲妥珠单抗耐药SKBR-3细胞的增殖并促进SKBR-3细胞的凋亡。赵伟等〔12〕通过LncRNA-ATB-shRNA有效沉默LncRNA-ATB在人淋巴瘤Ragi中的表达后，发现细胞增殖能力受抑制，凋亡能力提高，细胞周期停滞在G1期。本研究利用siRNA干扰载体沉默LncRNA-ATB构建了LncRNA-ATB低表达子宫内膜癌细胞Ishikawa、HEC-1-A细胞株，结果表明LncRNA-ATB可能作为癌基因，以相同的作用机制促进子宫内膜癌细胞增殖，抑制其凋亡。

上皮细胞间质化(EMT)是上皮细胞向间质细胞转化的过程，是肿瘤细胞获得侵袭和迁移能力的主要步骤〔13〕，当肿瘤细胞发生侵袭转移时，EMT可诱导肿瘤细胞获得耐凋亡、免疫豁免等干细胞特性，上皮细胞失去细胞间连接，细胞内细胞骨架重构，细胞的运动性增加，从而促进肿瘤的侵袭转移。EMT时表现为维持细胞上皮性基因表达降低，如细胞黏附因子(E-cadherin)，而表现细胞间叶性质的基因上调，如波形蛋白(Vimentin)、钙黏素(N-cadherin)〔14〕。研究证明miR-141-3P靶向抑制TM4SF1的表达进而抑制胰腺癌细胞的迁移与侵袭，乳腺癌细胞中miR-141-3P也有同样的作用〔15〕。ZEB1可以减少基底膜的合成，同时激活基质金属蛋白酶(MMP)1、MMP9、MMP14的表达，从而促进基底膜的重塑和细胞对周围组织的侵袭〔16〕。体外实验证明miR-200c高表达可以通过抑制靶基因ZEB1影响细胞EMT作用。LncRNA-ATB通过竞争性结合抑制miR-141-3P表达，促进EMT相关因子N-cadherin、Vimentin、ZEB1和ZEB2表达，并抑制EMT相关因子E-cadherin表达，促进EMT发生，增强乳腺癌的侵袭和转移能力〔17〕。本研究结果推测LncRNA-ATB增强子宫内膜癌细胞转移侵袭能力有可能是通过竞争性结合并抑制miR-141-3P/miRNA-200c的表达，促进肿瘤的EMT而实现。

综上，LncRNA-ATB可以调控促进子宫内膜癌细胞增殖、抑制凋亡并增强其转移侵袭能力，此研究结果将为子宫内膜癌转移的临床治疗提供重要的理论和实验依据，但其确切的分子机制还有待进一步研究。