夏枯草通过调控OPG/RANK/RANKL信号通路对骨肉瘤小鼠的抑瘤作用研究*

杜兵强，张伟霞，张连平

郑州市第六人民医院，河南 郑州 450000

骨肉瘤是一种原发性骨肿瘤，青少年是其高发人群，发病率高，每万人中有2～3例发病，由于其恶性程度高、复发率和病死率高，给患者带来巨大威胁[1]。目前，手术辅助化疗是骨肉瘤主要治疗手段，患者预后保肢率及存活率均得到有效提高，但仍有部分患者治疗效果不佳，出现骨转移，预后较差[2]。因此，探索新的、有效治疗骨肉瘤的药物对改善患者预后、延长生存期有重要意义。随着对恶性肿瘤研究的不断深入，中药在抗肿瘤及辅助治疗肿瘤方面愈来愈受到人们重视。唇形科植物夏枯草最早记载于《神农本草经》，具有清肝名目、消肿、软坚散结的功效[3]。关于其抗乳腺癌[4-5]、肝癌[6-7]效果已得到证实，但其对骨肉瘤的抑制作用鲜有研究。鉴于此，本研究通过建立骨肉瘤S180荷瘤小鼠，探讨夏枯草是否能通过调控骨代谢经典代谢通路OPG/RANK/RANKL发挥抑瘤作用。

1 材料

1.1 动物和细胞系60只SPF级健康昆明小鼠，雌雄各半，6周龄，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2018-0004，饲养于12 h/12 h明暗交替、23～25 ℃、湿度50%～60%的条件下，伦理学批号20200701；S180骨肉瘤细胞株，购自中国科学院上海生命科学研究院，货号：BS-C64870058。

1.2 药物和试剂夏枯草干燥果穗购自长沙高桥药材市场，经中国医学科学院药物植物研究所鉴定为唇形科夏枯草属植物夏枯草(PrunellavulgarisL)，粉碎加入10倍蒸馏水，加热回流提取4次，合并提取液并进行减压浓缩、冷冻干燥后备用。环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：160613)；吖啶橙溴乙锭(AO/EB)双荧光染色试剂盒(上海远慕生物科技有限公司，货号：YM-S1403)；逆转录试剂盒(苏州宇恒生物科技有限公司，货号：R2028)；BCA蛋白定量分析试剂盒(美国Bio-rad公司，货号：LIT33)；兔抗人OPG、RANK、RANKL抗体(美国Abcam公司，货号分别为：ab73400、ab193713、ab216484)；二抗(美国Abcam，货号：ab203061)。

1.3 仪器TCS SP8 X型激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)；Synergy H4 Hybrid酶标仪(美国Bio-Tek公司)；9700实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；ChemiDoc XRS型化学发光成像分析系统(Bio-rad公司)。

2 方法

2.1 骨肉瘤S180荷瘤小鼠模型建立及分组干预收集小鼠腹腔内传代6 d的S180腹水，生理盐水洗涤、离心和重悬后，调整细胞密度为2×107mL-1备用；所有小鼠均适应性饲养7 d后，随机取10只为对照组，剩余50只均于小鼠右侧腋窝皮下接种 0.1 mL 的S180腹腔传代细胞[8]，对照组接种 0.1 mL 生理盐水，同条件继续饲养，监测肿瘤直径至1 cm时，将荷瘤小鼠随机分为5组，即模型组、夏枯草低剂量组、夏枯草高剂量组、化疗组、夏枯草联合化疗组，每组各10只。夏枯草低、高剂量组分别灌胃1 g·kg-1、2 g·kg-1的夏枯草生理盐水，模型组和对照组灌胃生理盐水；化疗组腹腔注射 0.03 g·kg-1的环磷酰胺，隔日1次，夏枯草联合化疗组灌胃 2 g·kg-1的夏枯草生理盐水加隔日腹腔注射0.03 g·kg-1的环磷酰胺，各组均干预14 d。

2.2 观察指标

2.2.1 小鼠生存状态观察及肿瘤大小测量给药期间观察各组小鼠生存状态，于末次给药2 h处死小鼠，迅速剥离瘤块，去除杂质，生理盐水洗净擦干，称取瘤重，计算抑瘤率。

2.2.2 各组肿瘤病理组织学变化取部分瘤组织，置于4%的多聚甲醛中固定，经乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋，制作厚度为4 μm的连续切片；切片经脱蜡、水化，进行常规苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片后置于光学显微镜下观察肿瘤病理变化。

2.2.3 各组肿瘤细胞凋亡率比较取部分瘤组织制成单细胞悬液，进行吖啶橙溴乙锭(AO/EB)染色，荧光显微镜扫描拍照观察：呈亮绿色荧光，细胞质均匀为正常细胞；呈绿色荧光，细胞体积缩小或变性为早期凋亡细胞；呈浅黄色、棕色荧光，细胞形态改变为晚期凋亡细胞；呈橘红色固缩细胞为死细胞；每张照片随机选取4个视野，计数各种细胞数目。

2.2.4 OPG、RANK、RANKL基因表达检测取部分瘤组织，加入液氮研磨，Trizol一步法提取细胞内总RNA，酶标仪测定RNA浓度和纯度，采用逆转录试剂盒合成互补链cDNA；采用SYBR GREEN试剂盒进行实时荧光定量PCR，按照说明书设定反应体系，反应条件：95 ℃预变性60 s；95 ℃变性 15 s，57 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸60 s，重复42个循环。以β-actin为内参基因，2-△△CT为待测基因的相对表达强度，重复3次取Ct平均值，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.2.5 OPG、RANK、RANKL蛋白表达检测取约75 mg部分瘤组织，液氮研磨，然后加入0.5 mL细胞裂解液，10 000 r·min-1离心5 min(离心半径 12 cm)，收集上清进行蛋白定量。取20 μg待测样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，电转1 h至硝酸纤维素膜，加入封闭液摇床孵育2 h，加入稀释一抗，4 ℃摇床过夜，加入稀释二抗，常温孵育1 h，ECL化学发光试剂盒曝光、显影，应用凝胶成像系统扫描各蛋白条带灰度值，以待测蛋白与内参灰度值比值作为相对表达量。

3 结果

3.1 小鼠一般情况对照组小鼠均无异常，建模期间小鼠出现喜卧、反应迟钝、进食量下降、毛色暗淡等现象，且随着时间的延长逐渐加重；夏枯草组、化疗组及夏枯草联合化疗组小鼠干预期间，上述一般状况和精神状态均有所好转，其中夏枯草联合化疗组改善最为明显，模型组情况更加严重，干预14 d内各组均无死亡。

3.2 小鼠肿瘤组织的抑瘤率与模型组比较，其余4组瘤质量均明显减轻(P<0.05)；与夏枯草低剂量组比较，夏枯草高剂量组、化疗组、夏枯草联合化疗组瘤质量明显减轻、抑瘤率明显较高(P<0.05)；与夏枯草高剂量组比较，化疗组瘤质量、抑瘤率无明显差异(P>0.05)，夏枯草联合化疗组瘤质量明显减轻、抑瘤率明显较高(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠抑瘤率比较

3.3 小鼠肿瘤的病理组织学模型组肿瘤细胞排列紧密、细胞核大而深染，细胞膜完整；夏枯草低剂量组细胞核染色稍浅，部分呈现细胞核分裂、空泡或细胞膜轮廓不清现象；夏枯草高剂量组和化疗组上述状况进一步加重，出现细胞核固缩、胞浆增多现象，核分裂明显，坏死区域扩大；夏枯草联合化疗组呈现大面积浅色坏死区，仅有少量细胞结构完整。见图1。

注：A：模型组；B：夏枯草低剂量组；C：夏枯草高剂量组；D：化疗组；E：夏枯草联合化疗组图1 肿瘤病理组织学观察(×200)

3.4 小鼠肿瘤细胞的凋亡率与模型组比较，其余4组凋亡率均明显升高(P<0.05)；与夏枯草低剂量组比较，夏枯草高剂量组、化疗组、夏枯草联合化疗组凋亡率均明显升高(P<0.05)；与夏枯草高剂量组比较，化疗组无明显差异(P>0.05)，夏枯草联合化疗组凋亡率均明显升高(P<0.05)。见图2,表3。

注：A：模型组；B：夏枯草低剂量组；C：夏枯草高剂量组；D：化疗组；E：夏枯草联合化疗组图2 肿瘤组织单细胞悬液激光共聚焦观察

表3 小鼠肿瘤细胞的凋亡率

3.5 小鼠肿瘤组织中OPGmRNA、RANKmRNA、RANKLmRNA的表达与模型组比较，其余4组RANKmRNA、RANKLmRNA表达量均明显降低，OPGmRNA表达量及OPG/RANKL均明显较高(P<0.05)；与夏枯草低剂量组比较，夏枯草高剂量组、化疗组、夏枯草联合化疗组RANKmRNA、RANKLmRNA表达量均明显降低，OPGmRNA表达量及OPG/RANKL均明显升高(P<0.05)；与夏枯草高剂量组比较，化疗组OPGmRNA、RANKmRNA、RANKLmRNA表达量及OPG/RANKL无明显差异(P>0.05)，夏枯草联合化疗组RANKmRNA、RANKLmRNA表达量均明显降低，OPGmRNA表达量及OPG/RANKL均明显升高(P<0.05)。见表4。

表4 各组肿瘤组织中OPG mRNA、RANK mRNA、RANKL mRNA的表达

3.6 小鼠肿瘤组织中OPG、RANK、RANKL的蛋白表达与模型组比较，其余4组RANK、RANKL蛋白表达量均明显降低，OPG蛋白表达量及OPG/RANK均明显升高(P<0.05)；与夏枯草低剂量组比较，夏枯草高剂量组、化疗组、夏枯草联合化疗组RANK、RANKL蛋白表达量均明显降低，OPG蛋白表达量及OPG/RANKL均明显升高(P<0.05)；与夏枯草高剂量组比较，化疗组OPG、RANK、RANKL蛋白表达量及OPG/RANKL无明显差异(P>0.05)，夏枯草联合化疗组RANK、RANKL蛋白表达量均较低，OPG蛋白相对表达量及OPG/RANKL均明显升高(P<0.05)。见表5，图3。

表5 小鼠肿瘤组织中OPG、RANK、RANKL的蛋白表达

图3 Western blot图

4 讨论

骨肉瘤在原发性恶性肿瘤中发病率居首位，股骨、胫骨、肱骨及腓骨多见，其中病理分级较高可达88%，且约12%患者可出现早期转移，早期诊断和治疗至关重要[9-11]。骨肉瘤病因目前仍未明确，且发病机制复杂，涉及黏附分子、基因突变、免疫状况和凋亡等[12]。与其他恶性肿瘤相比，骨肉瘤的典型特征为肿瘤细胞具有成骨性，但其确切的成骨机制仍需进一步探讨[13]。常规化疗有助于改善患者症状，但仍有较高的复发率和转移率，5年生存率不足70%[14]。研究发现[15]，化疗药物抗药性、不良反应和肺转移是影响骨肉瘤转归的重要原因，寻找新的靶点治疗药物对改善骨肉瘤预后有重要意义。近年来，中药在抗肿瘤方面逐渐受到关注，我国中药资源丰富，寻找抗骨肉瘤中药有明显优势[16-17]。

夏枯草主要药物部位为其干燥果穗，中医用于治疗目赤脓肿、乳痈肿痛、头晕目眩等。现代医学发现，夏枯草对淋巴结核、高血压、甲状腺炎等均有较好治疗效果[18-20]。夏枯草含有多种活性成分，如三萜类、黄酮类、多糖类、有机酸等[21]，此类化合物均具有显著抗肿瘤作用。周亚敏等[22]分析夏枯草化学成分发现，从中分离的12种活性化合物中有5种均具有明显抑制乳腺癌细胞生长的作用。韦云妮等[23]体内实验发现，夏枯草对非小细胞肺癌荷瘤小鼠瘤体具有显著抑制作用，其中2.4 g·kg-1剂量的夏枯草效果最佳。本研究中各药物干预期间一般状况及精神状态均有所好转，肿瘤组织中肿瘤细胞坏死逐渐加重，其中夏枯草联合化疗组一般状况的改善和肿瘤组织病理学变化最为明显。与模型组比较，其余4组瘤质量均明显减轻，抑瘤率和凋亡率均明显升高，其中夏枯草低剂量组变化稍明显，高剂量组和化疗组其次，联合化疗组变化最为明显，提示夏枯草对S180骨肉瘤小鼠有显著抑制作用，且具有增强化疗效果的作用。

骨是机体代谢十分活跃的器官，骨吸收和骨合成在整个生命进程不断的发生。研究发现，OPG/RANK/RANKL在骨代谢中发挥重要调节作用，其相关活性因子间的平衡状态维持骨正常代谢状态，一旦失衡可导致骨肉瘤、骨质疏松症等骨疾病[24-25]。RANK是一种跨膜蛋白，属于NF-κB受体活化因子，是诱导下游c-Jun氨基酸激酶和NF-κB活化的关键因子，当RANK与位于细胞表面的配体RANKL结合后，可激活破骨细胞分化信号通路，参与骨吸收[26-28]。肿瘤坏死因子受体家族成员OPG属于骨保护蛋白，可竞争性结合RANKL，两者结合可抑制破骨细胞分化信号传递，发挥抑制骨吸收的作用，同时参与调控骨肉瘤细胞凋亡[29-31]。维持OPG-RANK-RANKL系统间的平衡状态对抑制骨肉瘤细胞增殖及促进凋亡十分重要。本研究应用不同剂量夏枯草及夏枯草联合化疗方法干预骨肉瘤小鼠，结果发现，与模型组比较，其余4组肿瘤组织中RANK、RANKL的基因和蛋白相对表达量均明显降低，OPG 的基因和蛋白相对表达量及OPG/RANKL均明显升高，且联合化疗组变化最为明显，提示夏枯草抑制S180骨肉瘤的作用可能机制为通过下调RANK、RANKL表达，上调OPG表达及OPG/RANKL的值，从而抑制骨肉瘤增殖、促进细胞凋亡。

综上所述，夏枯草对S180骨肉瘤小鼠有显著抑制作用，且具有增强化疗效果的作用，可能通过下调OPG/RANK/RANKL信号通路中RANK、RANKL表达，上调OPG表达及OPG/RANKL发挥作用，为夏枯草相关抗癌药物的研发提供理论参考。