通络地龟汤对1型糖尿病小鼠肾脏lncRNA、mRNA表达谱的影响*

庞欣欣，石秀杰，张雅歌，韩佳瑞，孙新宇

1.河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州 450002； 2.河南中医药大学，河南 郑州 450046

随着我国糖尿病人数的逐年增多，糖尿病肾病已经成为慢性肾脏病的首要病因，也成为糖尿病患者的主要死因之一[1-2]。目前现代医学尚缺乏有效的干预手段，中医药在糖尿病肾病的治疗方面具有独特的优势。不少经验丰富的名老中医药专家对该病认识深刻[3-4]，形成了一系列独具特色的经验方。不仅能改善糖尿病肾病患者的临床症状，降低蛋白尿，改善肾功能等预后指标，更能改善患者的生活质量。

全国名中医张炳厚教授为第二届全国名中医，第三届首都国医名师，全国首批中医药传承博士后导师。从医60余年，对糖尿病肾病具有独到的见解。张老认为本病基本病机在于“阴虚”和“血瘀”，治疗应注重养阴与活血。张老根据其经验方“地龟汤类方”拟定了通络地龟汤(TLDGD)，在临床应用取得了良好的效果，但其潜在的治疗机制尚不完全清楚。

人类基因组中只有约1%的基因可以编码为蛋白质，在剩余的基因中，约占4%～9%的大于200 nt的非编码转录本被定义为lncRNA[5]。既往认为lncRNA不具有功能，而近年来不少研究证实了lncRNA具有强大的基因调控作用，与众多疾病的发生发展密切相关，也是包括中医药在内的多种药物治疗疾病的重要靶点[6]。本研究拟通过腹腔注射链脲佐菌素制备I型糖尿病肾病模型，验证TLDGD对糖尿病肾病小鼠的治疗作用，并通过观察TLDGD对糖尿病小鼠治疗前后长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)和信使RNA(mRNA)表达谱的影响，探讨其潜在的机制。

1 材料

1.1 动物SPF级6周龄雄性C57BL/6N小鼠，购于北京维通利华实验动物中心，许可证号：No.11400700344642，体质量(20±3)g。本研究所涉及的实验经过河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)伦理委员会的批准，并按照相关要求严格执行(编号：KYLL20180925005)。

1.2 药物及试剂TLDGD[熟地黄20 g，龟板30 g(先煎)，烫水蛭12 g，生黄芪20 g，当归30 g，酒大黄15 g，泽泻10 g，甘草6 g]由我院制剂室提供，1 mL 相当于1.43 g生药。武火煎煮30 min，取药液 200 mL；二次加水，二煎文火煎煮30 min，取药汁200 mL；混合两次药液，共400 mL，煎煮至200 mL；再次浓缩，最后得药液100 mL，4 ℃保存。链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司，批号：S0130)；Trizol试剂(上海荔达生物科技有限公司，批号：RNAA00250)；Agilent小鼠lncRNA 4x180K芯片(美国Agilent公司，批号：049801)。

1.3 仪器SIGMA3K 超速低温离心机(美国 SigmaAldrich)；NanoDrop ND-2000(美国Thero Scientific)、MUL-TISKAN FC型酶标(美国Thermo Scientific)；Agilent Bioanalyzer 2100、Agilent Scanner G2505C(美国Agilent Technologies)；Veriti96 PCR仪(美国Thermo Elemental)；CFX96 荧光定量 PCR 仪(美国Bio-Rad Laboratories公司)；BS11OS精密电子天平(北京赛多利斯)(精确度 1/100 000)；稳豪型血糖仪[强生(中国)有限公司]。

2 方法

2.1 动物模型的建立C57BL/6N雄性小鼠50只，自由摄食摄水，动物室内光照12 h昼夜循环，室温22～25 ℃。适应性喂养普通饲料1周，随机选10只作为正常组，余40只作为模型组，予以高脂饲料喂养4周，禁食10 h后按50 mg·kg-1剂量腹腔注射STZ溶液(由pH 4.5柠檬酸钠缓冲液配置)，连续 5 d，正常组普通饲料喂养及腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。1周后剪尾法测随机血糖≥13.9 mmol·L-1为糖尿病模型成功[8]。

2.2 分组及给药糖尿病模型小鼠继续高脂饲料喂养8周，随机分为DKD模型组、DKD+TLDGD组。药物剂量换算参照剂量-体表面积换算法[7]，DKD+TLDGD组给予TLDGD(21.47 g·kg-1)灌胃，空白组及模型组给予相同体积的生理盐水灌胃，干预8周。

2.3 观察项目及方法

2.3.1 空腹血糖及生化指标检测每2周检测1次空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)和24 h尿蛋白(24 h protein，24 hPro)，末次给药后，禁食不禁水24 h，摘眼球取血，取肾脏，检测血清中血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的水平。

2.3.2 肾脏组织病理学观察取部分肾脏组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，脱蜡，水洗后进行苏木素-伊红染色(HE染色)、碘酸雪夫氏(PAS)染色、Masson染色，光镜下观察各组肾脏组织的病理改变。

2.3.3 总RNA提取和质量控制取小鼠肾组织各100 mg，样品总RNA利用NanoDrop ND-2000定量并经Agilent Bioanalyzer 2100检测RNA完整性。

2.3.4 RNA标记和芯片杂交RNA质检合格后，样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程。首先，总RNA反转录成双链cDNA，再进一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA。标记好的cRNA和芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C扫描得到原始图像。由上海欧易生物医学科技有限公司进行总RNA提取、芯片的杂交、数据读取和生物信息学功能分析工作。

2.3.5 数据采集和处理采用Feature Extraction软件(version10.7.1.1，Agilent Technologies)处理原始图像提取原始数据。接着利用GeneSpring GX软件(version 14.9，Agilent Technologies)对原始数据进行quantile标准化。利用T检验的P值和倍数变化值进行差异基因筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0且P≤0.05，同时对每组差异筛结果进行散点图，火山图(对应有生物学重复的分组)和聚类图绘制。

2.3.6 生物信息学功能分析使用GeneSpring GXv12.1软件对差异表达lncRNA靶基因进行基因本体论(GO)富集分析，以了解基因参与的生物学过程。利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库对差异基因进行Pathway分析，并利用超几何分布算法计算每个Pathway中差异基因富集的显著性。

3 结果

3.1 TLDGD对DKD小鼠肾功能、24 hPro及FBG的影响与正常组比较，DKD组Scr、BUN、24 hPro 和FBG均显著升高(P<0.01)；与DKD组比较，DKD+TLDGD组小鼠Scr、BUN、24 hPro和FBG均显著降低(P<0.01)。见图1。

注：Ctrl：正常组，DKD：模型组，DKD+TLDGD：模型+TLDGD组。**与正常组相比，P<0.01，##与模型组相比，P<0.01图1 TLDGD对各组小鼠血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、空腹血糖的影响

3.2 TLDGD对DKD小鼠肾脏病理的影响肾脏组织特殊染色显示正常组肾小球及肾小管结构清晰、完整，DKD组肾小球体积增加，胶原沉积明显，系膜基质增生，系膜区变宽，毛细血管环增多，肾小管上皮细胞肿胀，融合，坏死，DKD+TLDGD组以上病理损伤均得到明显改善。见图2。

图2 TLDGD对各组小鼠肾脏组织病理形态的影响(×40)

3.3 lncRNA-mRNA芯片检测TLDGD组和DKD小鼠肾组织之间的差异及分析

3.3.1 变异系数及检出率根据芯片的探针重复分别计算质控点和非质控点的变异(CV)值，一般CV值要求低于15%。本次检测结果中平均CV值为6.156 9，最大CV值为7.762 4，芯片实验成功。芯片的检出率，主要统计的是每个样本标记为检出的探针占总探针的比例。本次检测结果中最低检出率为57.87%，平均检出率为 59.31%，最大检出率为 61.85%。

3.3.2 散点图和火山图利用散点图展示了328个差异基因与其他非差异基因的分布情况，火山图显示，TLDGD治疗后，上调≥2倍的lncRNA有42个，下调≥2倍的有42个；上调≥2 倍的 mRNA 有132个，下调≥2倍的有57个。见图3。

注：DKD：模型组，DKD+TLDGD：模型+TLDGD组；(A)lncRNA散点图；(B)lncRNA火山图；(C)mRNA散点；(D)mRNA火山图。图上的每个点对应一个基因，横坐标对应DKD模型组的基因表达量，纵坐标对应TLDGD组的基因表达量。红色对应满足对应阈值的上调基因，蓝色对应满足对应阈值的下调基因，灰色为不满足对应阈值的基因图3 TLDGD组与模型组比较差异表达的lncRNA 和 mRNA 的散点图及火山图

3.3.3 聚类图对差异基因进行非监督层次聚类，根据数据的数学特征进行聚类，从而展示样本之间、基因之间的聚类关系。见图4。

注：A：lncRNA聚类；B：mRNA聚类。横坐标对应DKD模型组的基因表达量，纵坐标对应TLDGD组的基因表量。红色对应高表达，蓝色对应低表达图4 TLDGD组与模型组比较差异表达的lncRNA和mRNA聚类分析

3.3.4 lncRNA和mRNA芯片杂交取3个模型组肾组织和3个TLDGD治疗组的肾组织，采用芯片杂交方法对差异表达的lncRNA 进行筛选，筛选结果，差异表达的lncRNA共84 条，其中2 倍以上上调的有42条，下调的有42条；差异表达的 mRNA共189条，其中2 倍以上上调的有132条，下调的有57条；上调和下调最显著的 lncRNA 和 mRNA 见表1，表2。

表1 TLDGD组与模型组比较，发生下调或上调的lncRNA (n=3)

表2 TLDGD组与模型组比较，发生下调或上调的mRNA (n=3)

3.3.5 lncRNA靶基因预测和生物信息学分析对每一个lncRNA共表达的差异基因进行GO分析，发现lncRNA靶基因主要参与了炎症中的细胞迁移、炎症反应、细胞黏附、免疫学过程等生物学过程。靶基因细胞组分分析显示，靶基因可能主要来源于细胞外区域、细胞质膜、细胞膜和细胞外周。靶基因分子功能分析显示，靶基因主要有肽链内切酶抑制剂活性、肝素结合、信号受体结合、糖类结合等功能。见图5。

图5 lncRNA靶基因生物信息学分析

3.3.6 lncRNA靶基因信号转导通路分析对于每一个lncRNA共表达差异基因进行KEGG富集分析，分别筛选不同KEGG一级分类包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、代谢、有机系统等的信号通路。靶基因主要和PI3K-Akt信号通路、肌动蛋白细胞骨架、黏着斑、RAS信号通路、Rap1信号通路等相关。见图6。

图6 lncRNA靶基因信号通路分析

4 讨论

中医药治疗糖尿病肾病历史悠久，积累了丰富的经验，但仍存在中医药作用靶点、途径机制不明等不足之处，因此需要进一步探索其作用靶点及机制。随着现代生命科学的飞速发展，基因芯片技术和生物信息学领域日新月异，已广泛应用于开展复方中药治疗疾病的分子机制研究[9-10]。

张炳厚教授在肾脏病的诊治上积累了丰富的临床经验，总结了特有的补肾八法，特别是地龟汤类方治疗肾虚诸病及各种慢性肾脏病，疗效突出[11]。张老认为，糖尿病肾病基本病机特点应为“阴虚”与“瘀血”，且两者在病程中呈动态变化[12]，特别是疾病后期，瘀血重而阴虚轻，应重在破血通络，辅以滋补肾阴，故拟定TLDGD。我们课题组前期临床研究发现，TLDGD能减少糖尿病肾病IV期患者的24 h蛋白尿、改善肾功能并显著改善患者的中医症状积分情况[13]，并可通过增强自噬改善DKD小鼠足细胞损伤[14]。本研究通过体内实验发现，TLDGD可以降低DKD小鼠Scr、BUN、24 hPro和FBG，并改善其肾脏病理损伤。因此，探索该方治疗糖尿病肾病的分子机制意义重大。

随着lncRNA近年来研究热度不断增加，越来越多的研究表明lncRNA与糖尿病肾病关系密切。lncRNA结构与mRNA相似但不能编码蛋白质，在转录、转录后修饰等多个层面调控基因的表达。Kato等报道lnc MGC在糖尿病肾病小鼠模型的肾小球中表达增加，参与糖尿病肾病的发病过程[15]。Li X等发现，在高糖诱导的肾小管上皮细胞模型中，lncRNA MALAT1可通过靶向miR-23c上调ELAVL1和NLRP3炎症小体，导致细胞焦亡的发生[16]，因此lncRNA可能是糖尿病肾病治疗的重要靶点。lncRNA芯片技术能够快速高通量的获得与特定生物学过程或者疾病相关的lncRNA的表达变化，从而为后续的lncRNA功能研究或生物标志物筛选提供极大的便利。如吕小萌等[17]通过lncRNA芯片技术对健康人、糖尿病患者、糖尿病肾病患者循环血液样本进行检测对比，发现lncRNA-ARAP1-AS1/2在糖尿病和糖尿病肾病中异常表达，有望成为糖尿病和糖尿病肾病新的生物标志物。但目前糖尿病肾病的lncRNA研究较少，尚处于起步阶段。

本研究通过基因芯片技术筛选了TLDGD治疗组和糖尿病模型组差异表达的lncRNA及mRNA。其中表达差异最明显的lncRNA和mRNA分别是lncRNA dio3os和Npas2。Wang S等研究发现lncRNA dio3os可以作为炎症性肠病的新型生物标志物[18]；Cui K等发现lncRNA dio3os通过与miR-122相互作用，通过上调ALDOA促进胰腺癌细胞的增殖和侵袭[19]。但lncRNA dio3os在糖尿病肾病中未见文献报道，需要进一步验证研究。Npas2是最大的生物钟基因，位于人类第2号染色体的p11.2短臂上，基因长度约176.68 Kp[20]，Npas蛋白和BMAIL形成异源二聚体激活生物钟基因PERs和CRYs的表达[21-22]，表达紊乱时会增加2型糖尿病的风险。Npas2参与新陈代谢的调控，敲除Npas2的小鼠脂肪酸代谢发生异常[23-24]。Jacovetti等[25]发现Npas2在大鼠胰岛β细胞成熟过程中具有重要作用；Englund等[26]研究发现STZ诱导的糖尿病对大鼠肾脏的Npas2表达节律出现明显的提前，同时Npas2也可能是调节糖尿病大鼠自主活动的潜在因子。本实验中糖尿病小鼠经过TLDGD治疗后肾脏中显著上调的Npas2能否作为糖尿病肾病潜在的靶点，仍须未来更深入的研究证实。

本研究进一步对lncRNA靶基因鉴定及其功能富集分析，结果表明，其发挥作用的生物学过程主要包括炎症中的细胞迁移、炎症反应、细胞黏附、免疫学过程；细胞组分分析显示，靶基因可能主要来源于细胞外区域、细胞质膜、细胞膜和细胞外周；分子功能分析显示，靶基因主要肽链内切酶抑制剂活性、肝素结合、信号受体结合、糖类结合等功能。KEGG通路分析显示，靶基因的功能主要涉及PI3K-Akt信号通路、肌动蛋白细胞骨架、黏着斑、RAS信号通路、rap1信号通路等。

综上所述，本研究采用基因芯片技术，在全基因组水平上成功筛选出了TLDGD干预糖尿病模型小鼠肾脏大量差异表达的lncRNA、mRNA，通过生物信息学手段预测并揭示了其关键的靶点和通路，以上工作将有助于为TLDGD治疗糖尿病肾病提供新的思路。