针刺激痛点联合电冲击波对肌筋膜激痛点MTrPs大鼠海马表达的影响*

王兴瑜

黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040

骨骼肌结节处存在大量高度异常敏感小点即为肌筋膜激痛点(myofascial trigger points，MTrPs)，经触诊发现该处存在一条紧绷肌带[1]。隐性激痛点在受到创伤、免疫力下降、疲劳、机体姿势长期失衡及营养物质缺乏等刺激会转化为活化激痛点，从而导致关节功能受限、骨骼肌疼痛、自主神经功能紊乱及感觉异常等，甚至导致患者肢体功能丧失[2]。已有学者指出，对MTrPs进行针刺可起到灭活作用，通过观察患者疼痛改善情况、疼痛阈值、关节活动度及焦虑、抑郁指数等进行多方面证实，确定针刺MTrPs可起到良好效果[3]。采用体外冲击波干预，同样可起到治疗肌筋膜疼痛的作用。虽然已有大量学者投身于镇痛激痛点的研究，但关于该治疗的机理仍无统一定论，且现有研究主要集中在组织形态学及肌电生理学方面，关于分子生物层面的研究相对较少[4]。体外冲击波的治疗机制虽已明确，但是关于体外冲击对激痛点是如何发挥作用的研究却相对较少。本研究通过制备大鼠MTrPs模型，采用不同方式进行干预，分析针刺及电冲击波对大鼠海马Smad4和TGF-β1蛋白表达的影响。

1 材料

1.1 动物6周龄SD雄性大鼠60只，体质量220～250 g，由上海杰思捷实验动物有限公司提供，许可证号：SYXK(沪)2014-0002。饲养条件：温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，每日保持12 h的固定明暗周期。

1.2 试剂Smad4抗体(美国Abcam公司，批号：XY-E30413)；转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)抗体(美国Abcam公司，批号：XY-E30026)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(美国ThermalScientific公司，批号：BC-WB-005-500T)；Trizol(美国Invitrogen公司，批号：15596-026)；RNA-freeWater(德国QIAGEN公司，批号：129112)。

1.3 仪器MutiscanGo型全波长酶标仪(Thermo公司)；TissueRuptor型匀浆器(北京鼎昊源公司)；GIS-1600型凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；电泳槽和电泳仪(美国BIORAD公司)；热循环仪(美国LIFE公司)。

2 方法

2.1 模型制备与给药大鼠适应饲养1周后进行模型制备。将大鼠随机分为6组，每组10只，即空白组、模型组、针刺激痛点组、针刺非激痛点组、电冲击波组、针刺痛点冲击波结合组。除空白组外，其余大鼠复制MTrPs模型。每周第1天对大鼠进行打击处理，将其固定在自制模型上，取仰卧位，对标记部位垂直打击，用质量为1200 g的打击器，选择20 cm自由落体运动完成打击，动能约2.4 J，与大鼠腓肠肌接触面积约1 cm2，打击部位为大鼠左后肢腓肠肌中端偏上0.5～1 cm位置，导致该位置出现钝挫伤。打击后第2天对大鼠进行跑台离心运动，让其完成持续性下坡跑训练，该训练在倾斜角为-16°的电动动物跑台上进行，逐渐增加跑台转速，直至升至16 m·s-1，每次跑台训练时间为90 min，训练期间研究人员可采用声音、木棒等对大鼠进行刺激，保证其进行良好的运动。在后续5 d内对大鼠正常喂养，重复以上操作，进行为期8周的重复后，进入为期4周的修复期，修复期大鼠正常喂养，干预12周后完成MTrPs模型创建。采用国际公认MTrPs存在特征对动物模型建立成功与否进行判断。首先剔除大鼠后肢毛发，对造模部位触诊，可观察到大鼠左后肢造模部位存在挛缩结节，在结节处刺入第1支电极针，观察到存在肌肉跳动情况，在第1根电极针旁3～5 mm 处将另一电极针刺入作为参考电极，进行肌电装置连接，观察大鼠肌电活动情况，时间为 1 min，造模成功时会存在高频自发性电位，对该期间频率的波频、波幅及波长详细记录。

2.2 各组干预措施空白组大鼠不进行任何处理；模型组大鼠仅进行造模处理，但在完成造模后不对该组大鼠进行针刺或(和)电冲击波处理；针刺激痛点组大鼠在造模成功后进行针刺干预，对大鼠左后肢常规消毒，取针灸针对大鼠腓肠肌的4处激痛点针刺刺激，采用分层次提插方式，对相应的疼痛激痛点寻找，并内外上下4个方向进行灭活，在找准激痛点后，可观察到该部位肌肉出现抽搐颤动状，进行中等强度针刺，颤动次数为6次时出针，本次针刺治疗结束；针刺非激痛点组同样对其左后肢常规消毒，对腓肠肌的4处激痛点旁1～2 cm处针刺，观察进针后大鼠未发生肌肉颤动情况，同样为中等强度针刺，进行6次分层次提插后将针取出，治疗结束；体外冲击波组在完成造模后进行4周正常饲养，对大鼠麻醉后，在大鼠右股内侧肌处涂沫耦合剂，采用冲击波治疗仪(storzMP100型，瑞典)对其进行冲击波治疗，探头选择F15，剂量0.16 Mj·mm-2，冲击300次，频率1.3 Hz，每5 d进行1次，连续3次后对该组大鼠正常饲养；针刺联合电冲击波组在完成针刺后随即对其进行电冲击波治疗，针刺方案与针刺痛点组一致，电冲击波方案与电冲击波组一致，干预周期均为每周1次治疗，共4周。采用腹膜内注射戊巴比妥钠(60 mg·kg-1)对大鼠深度麻醉，确定其完全麻醉后，取其仰卧位，对股内侧肌解剖分离，取 1 cm3左右的组织切块，放入4%的多聚甲醛固定，无菌操作下剥离脑组织分离海马部分，用预冷的 PBS 洗涤去除残留血液和污染物，冲洗干净[5]，立即置于液氮中速冻，-80 ℃冰箱保存备用[6]。

2.3 观察指标

2.3.1 免疫组织化学染色采用免疫组织化学染色对股内侧肌组织切片处理，观察激痛点局部Smad4和TGF-β1表达。脱蜡处理，用体积分数为3%的双氧水灭活后过氧化酶滴加，时间 10 min；用微波炉对其进行加热，在沸腾后停止加热，自然冷却，将其置于pH值7.4的0.1 mol·L-1枸橼酸钠缓冲液中，时间10 min；用5%的BSA封固液封固处理在37 ℃下反应30 min；滴加兔大鼠Smad4和TGF-β1多克隆抗体，反应时间2 h，用PBS液反复冲洗，时间5 min，共3次；加入二抗，37 ℃下反应 30 min；用PBS冲洗，时间5 min，共3次；滴加ASBC溶液，时间30 min，温度为37 ℃，用PBS溶液清洗，时间 5 min，共4次；滴加DAB试剂，显色在室温下完成，反应时间15 min，在显微镜下控制；用蒸馏水洗涤，复染采用苏木精，完成染色后脱水、透明及封固等操作，在光学显微镜下观察[7]。

2.3.2 Western Blot法对大鼠海马中Smad4和TGF-β1的表达将海马剪切成碎片，用RIPA裂解液溶解，充分混合，离心半径8.5 cm，12 000 r·min-1，离心时间 5 min，分离上层清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，37 ℃，孵育30 min，562 nm处进行吸光度测量[8]，根据蛋白标准品浓度计算样本总蛋白浓度。每孔加样液30 μg，电脉后转膜，用封闭液稀释的GAPDH、Smad4及TGF-β1进行孵育，4 ℃，过夜；用TBST溶液洗膜，冲洗5 min，连续3次，加入HRP标记的羊抗兔二抗及HRP标记的羊抗小鼠二抗，室温下孵育2 h，用TBST溶液洗膜，每次 15 min，连续5次；加入化学发光检测试剂，反应2 min，将膜取出，甩去多余液体，用保鲜膜包好PVDF膜，在暗室中感光、显影以及定影[9-10]。

3 结果

3.1 各组大鼠波频、波幅及波长变化结果分析与空白组相比，模型组波频、波幅及波长均显著升高(P<0.01)；与模型组相比，针刺激痛点组、电冲击波组及刺痛点冲击波结合组的波频、波幅及波长均显著降低(P<0.01)，其中刺痛点冲击波结合组大鼠波频、波幅及波长下降最为明显。见表1。

表1 各组大鼠波频、波幅以及波长变化结果分析

3.2 免疫组化法检测TGF-β1及Smad4在大鼠股内侧肌的表达空白组大鼠股内侧肌内Smad4及TGF-β1呈现低表达状态，仅有少量区域被染为淡黄色；与空白组相比，模型组和针刺非激痛点组大鼠股内侧肌内Smad4以及TGF-β1呈现高表达状态，存在大量区域被染为棕色或棕黄色，光密度明显升高(P<0.05)。与模型组相比，针刺激痛点组、电冲击波组及刺痛点冲击波结合组Smad4及 TGF-β1 表达明显下降(P<0.05；P<0.01)。提示采用针刺激痛点联合电冲击波干预可降低大鼠Smad4及TGF-β1的表达。见表2，图1。

注：A：空白组；B：模型组；C：针刺激痛点组；D：针刺非激痛点组；E：电冲击波组；F：针刺痛点冲击波结合组图1 TGF-β1及Smad4免疫组化法检测结果

表2 各组大鼠股内测TGF-β1与Smad4的表达

3.3 Smad4及TGF-β1在大鼠海马中的表达与空白组相比，模型组大鼠海马中Smad4及 TGF-β1 蛋白表达显著升高(P<0.01)；与模型组组相比，针刺激痛点组、电冲击波组及刺痛点冲击波结合组可明显降低Smad4和TGF-β1蛋白表达(P<0.05)。见表3，图2。

表3 TGF-β1及Smad4在大鼠海马中的表达

注：A：空白组；B：模型组；C：针刺激痛点组；D：针刺非激痛点组；E：电冲击波组；F：针刺痛点冲击波结合组图2 TGF-β1及Smad4在大鼠海马中的表达

4 讨论

MTrPs的形成和发生过程比较复杂，目前对该疾病有多种假说。其中中枢敏化假说认为，若不能及时对MTrPs进行灭活，会因缺血、缺氧而导致局部刺激物堆积，使神经元附近的伤害感受器被激活，造成脊髓后角神经元池致敏，反复放大神经信号，增强神经元对阈值刺激的反应，进而导致中枢敏化的发生，在骨骼肌的反馈表现即为力学失衡或张力改变[11-13]。海马是中枢神经系统的重要组成部分，参与对伤害性感受信息(如神经损伤、炎症等)的加工、修饰及中枢整合。现有研究表明，神经病理性疼痛可导致海马神经元发生减少、体积缩小、突触可塑性降低等结构的改变[14]。已有研究发现，在激痛点局部组织处存在缺血、缺氧，且氧适应性、氧耐量明显降低，从而导致局部内循环灌注不佳情况的发生[15]。目前有研究发现，组织会因为低氧而发生炎症细胞浸润、水肿等，促进相关炎症因子及纤维化因子表达，对纤维细胞分化可起到促进作用[16]。

组织纤维化过程中TGF-β1/Smad信号转导通路起着重要作用[17]。经临床证实，对患者进行针刺治疗可降低其炎症因子水平，使IFN-γ水平上调、TGF-β1水平下调对组织纤维化产生抑制作用[18]。目前体外冲击波主要用于肾结石治疗，随着医学研究的不断拓展，体外冲击波的应用范围逐渐扩大，在骨折愈合不良、慢性疼痛及肢体康复治疗中，因其治疗具有无创、操作简单及不良反应小，其疗效逐渐得到临床认可[19-20]。关于体外冲击波对MTrPs治疗的研究不多，本研究通过观察不同干预方式下大鼠海马中Smad4及TGF-β1的表达，分析采用针刺激痛点联合电冲击波治疗MTrPs的作用机制[21]。

TGF-β1对多种靶基因的表达可起到调节作用，属于一种多功能多肽，在肠上皮细胞的分化、转移及增殖等过程中均发挥重要作用，对炎症细胞可起到趋化作用，促进成纤维细胞增殖分化，在细胞外基质生成过程中同样发挥着重要作用[22]。TGF-β1 属于机体内重要的抗炎因子，对所有淋巴细胞的增殖及其功能可起到抑制作用，同时抑制巨噬细胞激活，从而促进组织修复[23]。已有研究证实TGF-β1的抗炎具有双重作用，在其正常表达状态下，抑制炎症及细胞增生，但在其出现过度表达情况时，则可能导致病理性改变，如促进组织纤维化等[24]。Smads蛋白是一种重要的转导分子，对 TGF-β1 家族信号从受体到核传递有着重要的作用，属于TGF-β1与其受体的重要中介分子，而Smad4是TGF-β1信号传导必需的中转分子。已有研究指出，Smad4低表达可对成肌细胞及受 TGF-β1 诱导成肌纤维细胞的纤维化过程起到抑制作用[25]。有研究指出，体外冲击波所产生的机械效应与中医推拿相似，可降低肌张力，松懈组织粘连，对微循环起到改善作用，抑制疼痛物质的释放[11]。沿激痛点传播方向由冲击波导致介质出现压缩与膨胀情况，从而产生机械应力，达到软组织松懈及弹性变形[26]。体外冲击波可有效促进局部血管扩张，改善局部组织血液循环，促进新组织形成，有利于肌腱恢复[27]。本研究显示，针刺激痛点组、电冲击波组及刺痛点冲击波结合组的波频、波幅及波长均显著降低，同时可显著下降股内侧肌和海马组织Smad4和TGF-β1的表达，而采用针刺激痛点联合电冲击波可有效降低Smad4和TGF-β1表达，从而使激痛点局部纤维得到改善。综上所述，采用针刺激痛点及联合点冲击波进行治疗，可降低海马中Smad4和TGF-β1蛋白表达，分析其可能与针刺MTrPs的镇痛机制存在相关性。