MC1-R在人病理性瘢痕组织中的表达及临床意义＊

刘毅 蔡琼珠 吴小雅 杨习端 陈超明 黄华森

病理性瘢痕又称异常瘢痕，包括增生性瘢痕（HS）和瘢痕疙瘩（K），其形成机制尚未明确。作为整形外科的世界性难题，病理性瘢痕的形成一直困扰着整形外科医生，而临床上也未有行之有效的治疗措施[1-2]。因此，研究病理性瘢痕形成的机制，为治疗寻找新干预靶点，是该领域需要解决的关键问题。在20世纪七八十年代，Ouyang等[3]、Madu等[4]就注意到有色人种在垂体功能亢进、青春期及妊娠期等皮肤色素易沉着时期较易形成病理性瘢痕，而白化病患者则完全不形成病理性瘢痕。因此，多年来人们推测病理性瘢痕的形成与皮肤色素沉着有着某种内在联系，但对此并未进行深入的研究。皮肤颜色的差异是由优黑素和褐黑素的比例所决定，而优黑素与褐黑素的比例是由黑色素皮质素受体1（melanocortin receptor l，MC1-R）所调控[5]。因此，MC1-R表达是此类研究的一个重要方向。本研究以病理性瘢痕患者为研究对象，通过免疫组化检测病理性瘢痕和正常皮肤内MC1-R表达水平和定位情况，以期明确MC1-R与病理性瘢痕形成之间的关系，具体如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年9月-2019年10月于湛江中心人民医院整形外科手术标本，包括增生性瘢痕15例，瘢痕疙瘩10例，以及另取来自术中弃用的正常皮肤样本20例。正常皮肤样本取自体表多个部位的术中弃用皮肤组织，取材部位包括颜面部、腰腹部；增生性瘢痕样本所取瘢痕形状呈不规则，高于正常皮肤且色红质硬，局部伴瘙痒或痛觉过敏，取材部位包括四肢、面部、胸腹部。瘢痕疙瘩样本所取瘢痕疙瘩呈蟹足状、质坚硬，取材部位包括面部、腹部。排除标准：存在慢性皮肤病史、周围神经病变，术前接受其他治疗。三组性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。所有样本均来自医院整形外科手术患者，组织样本采集前均告知患者及其家属试验计划和样本去向，并签署知情同意书。该研究经医院伦理委员会批准同意。

表1 样本来源信息

1.2 方法

1.2.1 材料处理 样本于术中取下后，立即置入4% 多聚甲醛固定液中过夜，第2天进行常规梯度脱水、浸蜡和石蜡包埋。组织石蜡块进行切片，以备免疫组化染色用途。

1.2.2 免疫组化染色与结果判定 将石蜡切片进行脱蜡和水化处理，进行酸性抗原修复10 min后，再次将切片于PBS中浸泡3次5 min/次；随后，经阻断内源性过氧化物酶活性10 min，将切片于PBS中浸泡3次，5 min/次。室温下，采用10% BSA封闭液进行封闭非特异性抗原2 h，加抗MC1-R抗体（1∶100稀释）于4 ℃湿盒过夜；次日滴加1∶200稀释生物素化二抗，37 ℃恒温孵育20 min。滴加1∶200稀释链霉菌素抗生物素过氧化物酶复合物即三抗，37 ℃恒温孵育20 min，各步骤之间均用缓冲液洗3次。采用AEC显色后苏木精复染。最后进行中性树脂封片、镜下观察和拍照，每个组织切片随机选取5个视野，计算每个视野的MC1-R阳性细胞百分比。MC1-R阳性信号呈黄色或棕黄色颗粒，MC1-R阳性细胞百分比=（MC1-R阳性细胞数/细胞总数）×100% 。所有切片均在同一台显微镜下由同一研究人员拍摄。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析；计数资料以率（% ）表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果MC1-R定位情况

三组样本中进行MC1-R免疫组化检测，评估MC1-R蛋白在正常皮肤组织、增生性瘢痕组织和瘢痕疙瘩组织中的表达水平和定位。MC1-R阳性信号呈黄色或棕黄色颗粒，其表达于表皮及真皮层。在正常皮肤中，MC1-R阳性表达多位于表皮基底层和皮肤附属器周围；在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中，MC1-R阳性表达见于表皮的基底层和真皮层中成纤维细胞聚集处。

2.2 三组免疫组化结果MC1-R定量比较

正常皮肤组MC1-R阳性表达百分比为（53±10）% ，高于增生性瘢痕组的（45±7）% 和瘢痕疙瘩组的（32±9）% ，且增生性瘢痕组MC1-R阳性表达百分比高于瘢痕疙瘩组，差异均有统计学意义（F=3.007，P＜0.001）。

3 讨论

病理性瘢痕较易发生于有色人种和皮肤色泽较深的人群，发生率与正常人之比为2∶1～19∶1[6]。当垂体功能亢进，青春期、妊娠期等皮肤色素沉着明显时也较易发生。因此，多年来人们推测病理性瘢痕的形成与皮肤色素沉着有着某种内在联系，但对此并未进行深入的研究。皮肤颜色的差异是由优黑素和褐黑素的比例所决定，而优黑素与褐黑素的比例是由MC1-R所调控。因此MC1-R表达数量的不同，导致了皮肤色泽的不同。MC1-R广泛分布于皮肤细胞上[7]，在真皮成纤维细胞、微血管内皮细胞亦表现出较高的MC1-R抗原性[8-9]。它能介导所有由褪黑素（α、β、γ-MSH和肾上腺皮质激素）诱导皮肤细胞所产生的免疫、炎症反应、细胞外基质沉积等多种效应[10]。而病理性瘢痕的形成与免疫反应，细胞外基质及真皮内微血管关系密切[11-12]，因此，采用免疫组织化学方法检测病理性瘢痕组织，普通瘢痕组织及正常皮肤组织中MC1-R含量，并比较其差异，探讨病理性瘢痕形成与皮肤颜色变化之间的关系，从而从另一角度推测出病理性瘢痕形成的机制，目前国内外学者的研究主要集中在胶原代谢，细胞因子等领域[13-14]，对MC1-R在病理性瘢痕组织中的表达等研究报道尚少。

因此，本研究设计之初推测病理性瘢痕的形成与黑色素细胞的活动，尤其是调节色素沉着的MC1-R，存在着某种内在的联系。然而，采用免疫组化法检测病理性瘢痕（包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩）和正常皮肤组织内MC1-R含量的变化，对其进行比较和分析，发现皮肤组织内表皮和真皮层成纤维细胞内MC1-R表达水平在瘢痕组表达明显下降，MC1-R不足的成纤维细胞可能更有助于病理性瘢痕的形成。此结果趋势与肤色色素沉着的推测不相符，而与Luo等[15]研究结果一致。Luo等对成纤维细胞和人瘢痕疙瘩组织内的MC1-R表达进行评估，并验证了激活的a-黑素细胞刺激激素的（aMSH）/MC1R信号通路对皮肤炎症、纤维化反应和色素沉着存在拮抗作用。

本研究基于免疫组化技术，通过检测人病理性瘢痕、正常皮肤组织中MC1-R含量的变化，对其进行比较和分析，从而揭示病理性瘢痕形成和MC1-R表达变化之间的内在关系，为病理性瘢痕的诊治提供新靶标。然而，关于不同人种肤色之间病理性瘢痕形成与MC1-R表达的联系尚未研究，仍需在未来的研究中进一步探明。