饲料中蛋白质含量及养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼生长性能、氮排泄及相关生化指标的影响*

张 晓 梁萌青 卫育良 廖章斌 张庆功 徐后国

(1. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306；2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071；3. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071)

环境因素是对鱼类生长最重要的因素之一，养殖环境通常会对鱼类的营养需求产生影响。不适宜的养殖密度、养殖水温和水体盐度，以及水中过高的氨氮含量等都会对鱼类的生长产生不利的影响。养殖密度作为一种非常重要的环境胁迫因子，对鱼类的生长、发育、代谢等生命活动具有显著的影响，养殖密度过高和过低都会对鱼类的生长产生负面影响(曹阳等,2014)。养殖密度过高会造成鱼类生存空间的拥挤以及水质的恶化，鱼体长期处于应激状态，严重时导致死亡(Allen, 1974; Suresh et al, 1992)。然而，在实际养殖生产过程中，养殖户通常会通过提高养殖密度来增加效益(Zhu et al, 2011)，养殖密度对营养需求和代谢的影响需要进行科学地评估。养殖密度可能会影响饲料中营养物质的利用率，而且，密度造成的胁迫还可能改变养殖鱼类的能量消耗状态，从而影响机体营养物质的积累。

蛋白质在鱼类营养中具有非常重要的功能，是动物生长、发育和维持机体正常生命活动的必需营养素(刘永坚等, 2002)。饲料蛋白质水平的变化不仅影响消化酶活性和蛋白质合成，调节内分泌激素的合成，还直接影响细胞内氨基酸库的变化，从而影响蛋白质的周转，最终影响鱼体生长和健康(秦钦等, 2018)。蛋白质供应不足会阻碍鱼类的生长发育和繁殖，导致生长速度下降，而蛋白质过量不仅能抑制鱼类生长，而且增加鱼体的负荷、提高养殖成本，造成不必要的浪费。鉴于养殖密度和饲料蛋白含量在影响鱼体蛋白代谢和能量供应方面具有某些共同的路径，因此，本研究拟通过两因素三水平实验，同时评价养殖密度和饲料蛋白含量在影响鱼体生长和代谢方面的交互作用。

红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)是东亚地区重要的高价值养殖鱼类，随着2016 年农业部办公厅和国家食品药品监督管理总局联合发布《关于有条件放开养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀加工经营的通知》，其养殖和市场推广大大提速，显示出良好的市场前景。在对红鳍东方鲀蛋白质需求的研究中，有研究发现，红鳍东方鲀幼鱼饲料中适宜的蛋白质含量应为41%左右(王淑敏, 2008; Kim et al, 2009)，也有研究表明，红鳍东方鲀饲料中最适蛋白质含量为50%左右(朱钦龙, 2003; 杨州等, 2002)，不同研究结果间存在一定的差异。而关于红鳍东方鲀养殖密度对生长及代谢的影响，目前，国内外尚未见相关研究报道。鉴于如前所述蛋白营养生理和密度因素可能存在的交互作用，尤其是对于红鳍东方鲀等具有较严重撕咬残食行为的养殖鱼类，研究不同养殖密度下的蛋白营养需求及养殖密度和饲料蛋白水平在影响鱼类生理代谢中的交互作用，对阐明水产动物的精准营养调控具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验设计

本实验通过向基础饲料中等梯度添加0、7.5%和15%的酪蛋白，配制成3 种不同蛋白质梯度水平的等脂的半精制饲料，实验饲料配方如表1。其中，蛋白水平分别参照Kim 等(2009)和朱钦龙(2003)的方法。经测定，各组饲料的实际蛋白质含量分别为38.87%、45.55%和51.00%。所有原料测定常规成分后，经粉碎机粉碎，过80 目筛网，按配方称量原料，逐级混匀，然后加鱼油和大豆卵磷脂混匀，加30%水搅拌均匀。用制粒机制成直径为2 mm 的颗粒饲料，55℃鼓风干燥12 h 后置于–20℃冷库保存。

表1 实验饲料配方及营养成分组成(%干物质)Tab.1 Formulation and proximate composition of the experimental diets (% dry matter)

1.2 实验鱼和养殖管理

实验用鱼来自大连天正有限公司河北唐山育苗场人工孵化的同一批鱼苗，体重为15 g 左右，用商业配合饲料投喂14 d 驯化。正式实验前，在暂养桶(直径为230 cm，高度为100 cm)中暂养7 d 后，对每尾幼鱼剪牙，剪牙后继续暂养7 d 以适应养殖环境。挑选规格一致、健康无病的鱼苗进行分组实验。养殖实验在山东省烟台海阳市黄海水产公司基地养殖桶(方形，70 cm×70 cm×40 cm)中进行，设置3 个不同密度和3 个不同蛋白梯度的交互实验，共9 组，每组3 个重复。3 个不同密度的养殖桶(0.196 m3)分别放20、30 和40 尾鱼苗，在每天08:00 和19:30 手工缓慢投喂至表观饱食。养殖周期为56 d，养殖期间记录每天的摄食、死鱼数量和重量，监测海水温度、盐度和溶解氧(DO)等。养殖过程中，养殖车间采用自然光周期，流水养殖，水温为20℃～27℃，盐度为30～31，pH 为7.4～8.2，溶解氧为5～7 mg/L。

1.3 实验取样

养殖实验结束饥饿24 h 后，对每桶鱼进行计数和称重，随机在每桶中取6 尾鱼，取每条鱼的血液、肠道、肝脏和肌肉样本。采用尾静脉取血液方式，采集血液样本置于4℃过夜后，3500 r/min 离心5 min，取上层血清，置于液氮中保存。将鱼解剖后收集同一部位肠道、肝脏和肌肉样品。所有样品立即置于液氮中保存，再转移到–80℃冰箱中储存备用。取样结束后，随机挑选4 条全鱼放入–20℃备用，用于体成分分析和计算肝体比、脏体比和肥满度。

1.4 生化分析

饲料、饲料原料以及实验开始前和结束后鱼体样品、鱼体肌肉常规成分的分析全部采用AOAC(1995)的方法。其中，样品在(105±2)℃烘干至恒重后求得水分含量，蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法(VELP,UDK142 automatic distillation unit, VELP, Usmate, MB,意大利)；脂肪采用索氏抽提仪测定(Foss Tecator,Hoganas, 瑞典)，以石油醚作为抽提液；灰分是将样品在电炉上炭化后，在550℃马福炉中灼烧6 h 后测得。血清、肠道和肝脏的酶活均采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。

1.5 水质测定与分析方法

总氨氮的测定采用次溴酸钠氧化比色法，亚硝氮采用盐酸萘乙二胺分光光度法，分析方法参照《海洋调查规范》。

1.6 计算方法及统计分析方法

增重率(Weight gain, WG, %)=(终末重–初始重)/初始重×100

饲料效率(Feed efficiency ratio, FER)=体重增加量(g)/摄食量饲料干重(g)

摄食率(Feeding rate, FI, %/d)=摄食饲料干重/[实验天数×(初始体重+终末体重)/2]×100

存活率(Survival rate, SR, %)=实验结束时活鱼总数/实验开始时活鱼总数×100

肥满度(Condition factor, CF)=体重(g)/体长3(cm)×100

肝体比(Hepatosomatic index, HSI, %)=肝脏重(g)/体重(g)×100

脏体比(Viscerosomatic index, VSI, %)=内脏重(g)/体重(g)×100

采用SPSS 20.0 软件对所得数据进行双因素方差(Two-way ANOVA)分析，当差异显著时(P＜0.05)，采用Tukey 检验进行多重比较；当2 个因素有交互作用时，则固定一个因素，对另一个因素进行Tukey 多重比较。结果以平均值±标准误(Mean±SE)表示。

2 结果

2.1 不同饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼生长、饲料利用和鱼体组成的影响

不同饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼生长的影响如表2 所示。各组存活率介于54%～68%，存活率无显著差异(P＞0.05)。本实验成活率总体偏低是由于养殖期间，遭遇急性高温天气导致。高蛋白和中蛋白饲料组的终末体重和增重率显著高于低蛋白组(P＜0.05)，而高蛋白和中蛋白饲料组间无显著差异。高蛋白组饲料效率显著高于低蛋白组(P＜0.05)，而中蛋白组与高、低蛋白组间相比无显著性差异(P＞0.05)。各密度组饲料效率和增重率无显著性差异(P＞0.05)。饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼生长指标的影响无显著性交互作用(P＞0.05)。

饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼全鱼体成分的影响如表3 所示。各组之间粗成分无显著差异(P＞0.05)，鱼体粗蛋白含量随饲料蛋白含量的升高有升高的趋势。

2.2 饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼氨氮排泄的影响

饲料蛋白含量及养殖密度对红鳍东方鲀氨氮排泄率的影响如图1 所示。不同蛋白质饲料组静水投喂3 h 后，氨氮排泄率无显著差异(P＞0.05)，高密度组静水投喂 3 h 后，氨氮排泄率显著高于低密度组(P＜0.05)，中密度组与高、低密度组相比无显著差异(P＞0.05)，饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼氨氮排泄的影响无显著性交互作用(P＞0.05)。

2.3 饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼血清、肠道和肝脏相关生化指标的影响

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表3 不同饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀全鱼体成分的影响(平均值±标准误，n=3)Tab.3 Effects of different dietary protein contents under different stocking densities on whole-body proximate composition of T. rubripes (Mean±SE, n=3)

图1 饲料蛋白含量及养殖密度对红鳍东方鲀氨氮排泄率的影响(平均值±标准误，n=3)Fig.1 Effects of different dietary protein contents on ammonia nitrogen excretion rate of T. rubripes under different stocking densities (Mean±SE, n=3)

饲料蛋白含量及养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼营养代谢相关生理生化指标的影响如表4 所示。当养殖密度一定时，血清总蛋白含量中低蛋白组显著高于中蛋白组(P＜0.05)，高蛋白组和中、低蛋白组间无显著差异(P＞0.05)。当饲料蛋白一定时，高密度组的血清总蛋白含量显著高于中密度组(P＜0.05)，低密度组和中、高密度组相比无显著差异(P＞0.05)。饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼血清总蛋白含量的影响具有显著性交互作用(P＜0.05)。高密度组的血清胆固醇含量显著高于中密度组(P＜0.05)。低密度组与中、高密度组相比无显著性差异(P＞0.05)。当养殖密度一定时，血清碱性磷酸酶含量在低蛋白组显著高于高蛋白组(P＜0.05)，中蛋白组和低、高蛋白组相比无显著差异(P＞0.05)，饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼血清碱性磷酸酶含量的影响具有显著性交互作用(P＜0.05)。各处理组肠道中胃蛋白酶和胰蛋白酶没有显著性差异，但是在中高密度组中，随着饲料蛋白含量的升高具有上升的趋势。

饲料蛋白含量及养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼抗应激相关生化指标的影响如表5 所示。血清和肝脏中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶并无显著差异(P＞0.05)。血清中皮质醇和血糖含量也没有显著差异(P＞0.05)，但在中高蛋白组中，随着养殖密度的增加都具有上升趋势。

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表5 饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀抗应激相关生化指标的影响(平均值±标准误，n=3)Tab.5 Effects of dietary protein content and culture density on serum and liver biochemical parameters of tiger puffer (Mean±SE, n=3)

3 讨论

3.1 饲料蛋白含量及养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼生长、饲料利用和鱼体组成的影响

鱼类的增重率和饲料效率一直被认为是生长方面最重要的指标之一，本实验中，增重率在高、中蛋白组显著高于低蛋白组，而在高、中饲料蛋白组间无显著性差异。饲料效率也得到了类似的结果。本研究表明，45.55%饲料蛋白质含量已经能满足红鳍东方鲀幼鱼正常生长的需求。但有研究表明，为使红鳍东方鲀幼鱼获得较好的生长速度，饲料中最适粗蛋白质含量应该在50%左右(杨州等, 2002; 朱钦龙, 2003)。本研究结果与这些研究间的差异可能主要是因为养殖环境和实验条件不同造成的。本研究中，由于养殖中后期水温过高，鱼存活率较低，各组存活率介于54%～68%，存活率无显著性差异。在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) (王峰等, 2015)、点带石斑鱼(Epinephelus coioides)(王楠楠, 2015)等鱼中发现，随着养殖密度的增大，存活率呈下降趋势，这与本研究有所不同。

本研究表明，各密度组增重率无显著差异，这与乌鳢(Ophiocephalus argus Cantor)的放养密度对增重率无显著性影响的结果相似(原居林等，2017)。但也有学者研究发现，随着养殖密度的升高，增重率会出现明显下降的趋势，在对龙纹斑(Maccullochella peelii)(张庆阳等, 2015)、点带石斑鱼(Epinephelus coioides)(逯尚尉等, 2011)、褐鳟(Salmo trutta)(王炳谦等, 2014)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)稚鱼(江仁堂,2009)的研究中发现，随着养殖密度的升高，增重率会出现明显下降的趋势。本研究中，各密度组增重率显著性差异的缺失，可能主要是由于实验后期随着死亡率增加，养殖密度并未达到对红鳍东方鲀幼鱼的生长产生不利影响的密度。

本研究设定的3 种饲料蛋白含量和3 种养殖密度对红鳍东方鲀形体指数和粗成分之间均无显著影响，但随着饲料蛋白含量的增加，粗蛋白含量有上升的趋势。或许更加优化的实验条件和更长的养殖周期能够使蛋白方面的差异显著显现出来。

3.2 不同饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀氨氮排泄的影响

高养殖密度常引起水质恶化，氨氮浓度过高，进而导致鱼类组织溃烂和呼吸功能受阻，损伤鱼类的抗氧化系统和免疫系统等。氨氮作为水质检测中的重要指标之一，其主要存在形式是游离态氨和离子态铵，其对评价水体生态环境和水体功能具有重要意义(曾巾等, 2007)。当水中的氨氮浓度过高时，会对鱼鳃等免疫器官造成损害，降低鱼类的免疫力，引起病变甚至造成死亡(Colt et al, 1981)。本研究中，经过56 d 的养殖，在3 h 静水氨氮排泄实验中，中、高密度组的氨氮排泄率高于低密度组，各蛋白组间无显著差异。结果表明，高密度养殖造成了氨氮排泄量的增加，使水体中氨氮含量升高。对大菱鲆(Scophthalmus maximus)的研究发现，高密度组的氨氮浓度显著高于中、低密度组(韩岑等, 2017)，在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)(郑乐云等, 2013)和鳜鱼(Siniperca chuatsi)(古勇明等,2015)的研究中也得到一致的结果。这说明高密度的养殖的确会增加水体中氨氮的排泄率，长期下去会对养殖水体产生不利的影响，氨氮的积累有可能造成养殖鱼类患病，甚至死亡。因此，在进行高密度养殖时，需要考虑增加降低水体氨氮的措施。

3.3 不同饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀血清、肝脏、肠道相关生化指标的影响

蛋白酶活性的高低与饲料中蛋白质水平关系紧密(钟国防等, 2019)。在牙鲆(Paralichthys olivaceus)(李金秋等, 2005)、鲈鱼(Lateolabrax japonicus)(陈壮等, 2014)等的研究中发现，在一定范围内，随着饲料蛋白水平的提高，蛋白酶活性呈升高的趋势。本研究中，饲料蛋白质含量和养殖密度没有使胃蛋白酶、胰蛋白酶产生显著差异，出现这种结果的原因可能是红鳍东方鲀幼鱼对40%～50%的饲料蛋白含量不敏感。血清总蛋白是机体蛋白质的一个来源，用于修补组织和提供能量。血清总蛋白和白蛋白含量在一定程度上反映了机体对蛋白质的消化吸收程度和代谢状况(Coma et al, 1995)。血清蛋白质(白蛋白和球蛋白以及总蛋白)的含量与动物对饲料蛋白质的摄取量有关，同时受内源蛋白质分解代谢、外界环境等众多因素的影响(李辉等, 2009)。本研究中，血清白蛋白含量没有显著性差异。当养殖密度一定时，血清总蛋白含量在低蛋白组显著高于中蛋白组，高蛋白组和中、低蛋白组相比无显著差异。说明39%蛋白质含量的饲料刺激了红鳍东方鲀幼鱼血液中的蛋白质更替速度。当饲料蛋白一定时，高密度组的血清总蛋白含量显著高于中密度组。这在团头鲂(Megalobrama amblycephala)幼鱼的研究中发现，团头鲂血清中总蛋白含量随着养殖密度的升高显著增加的研究结果相似(亓成龙等, 2014)。在对俄罗斯鲟(Acipenser gueldenstaedti)幼鱼的研究中也发现，高密度养殖条件下血红蛋白含量显著升高(曹阳等, 2014)。

甘油三酯是营养物质被机体消化吸收后在血液里的主要形式，反应了脂肪代谢的基本状况。血清中的甘油三酯和总胆固醇浓度反应了机体摄取或合成甘油三酯和总胆固醇的能力。碱性磷酸酶是一种磷酸单脂酶，可催化单脂的水解反应，是生物体内的一种重要的与蛋白质、脂质有关的代谢调控酶(黄金凤等,2013)。在大菱鲆的研究中发现，高密度组大菱鲆的血浆胆固醇含量显著高于低密度组(贾瑞, 2016)。本研究中，高密度组的血清胆固醇含量显著高于中密度组。说明较高的养殖密度会增加总胆固醇的合成，从而对脂肪代谢产生一定影响。同样，在对团头鲂幼鱼的研究中也发现，团头鲂血清中总胆固醇含量随着养殖密度的升高显著增加。当养殖密度一定时，低蛋白组血清碱性磷酸酶活性显著高于高蛋白组。说明39%含量的饲料蛋白质会对红鳍东方鲀幼鱼血液中的脂肪代谢产生一定影响，但具体产生影响的代谢机理有待进一步研究。

糖、蛋白质和脂肪是鱼类的主要能量来源，其中，葡萄糖是营养物质被机体消化吸收后在血液里的主要形式，反应了糖代谢的基本状况(周顺伍, 1999)。高密度养殖会造成养殖鱼类的应激反应，水产动物受到环境因子刺激后，下丘脑可分泌促肾上腺皮质激素释放激素传递至脑下腺，垂体前叶受到促肾上腺皮质激素释放激素调节，将分泌促肾上腺皮质激素，传递到肾间组织，产生皮质类固醇释放至血液中(Barton,2002)。血糖和皮质醇的含量常用来评价鱼类应激情况(Barton et al, 1991)，高密度胁迫下，皮质醇水平升高可能是鱼类对能量需求增加以适应胁迫环境的反应(Pickering, 1989)。在高密度养殖条件下，虹鳟血液中皮质醇浓度会上升(Barton et al, 1987)，在点带石斑鱼幼鱼的研究中也发现，高密度组中的血糖和皮质醇的含量显著高于低密度组(逯尚尉等, 2011)。本研究中，饲料蛋白含量和养殖密度并未对红鳍东方鲀幼鱼葡萄糖和皮质醇产生显著影响，但随着养殖密度的升高，血浆中的血糖和皮质醇含量均有上升趋势。这与在大菱鲆(贾瑞, 2016)、俄罗斯鲟(曹阳等, 2014)和点带石斑鱼(逯尚尉等, 2011)的研究中养殖密度的升高会使血糖和皮质醇含量升高的研究结果相似。谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性与机体氨基酸的分解转化关系密切相关(Berge et al, 1998)，这2 种酶的活性升高说明氨基酸被大量分解以供能。在本研究中，血清和肝脏中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶均无显著差异，可能与养殖后期不利的养殖条件有关。

4 结论

研究表明，在本实验条件下，45.55%饲料蛋白质含量已经能满足红鳍东方鲀幼鱼正常生长的需求。较高的养殖密度3.06 kg/m3会增加水体中的氨氮排泄率，对养殖水环境产生不利的影响。饲料蛋白含量和养殖密度对红鳍东方鲀幼鱼的生长、氨氮排泄没有显著性交互作用，但会在一定程度上影响机体的蛋白代谢和脂肪代谢。