杂交黄颡鱼hsp70 基因核心序列的克隆、表达及其在高温应激下的组织表达*

朱凌威 张朝阳 刘 钊 李良玉 唐 洪 赵仲孟陈雨薇 武佳韵 黄小丽 杨世勇①

(1. 四川农业大学动物科技学院 成都 611130；2. 四川农业大学生命科学学院 雅安 625014；3. 成都市农林科学院水产研究所 成都 611130)

温度是鱼类生长发育过程中重要的环境因子，鱼类作为变温水生脊椎动物，温度对其生长、代谢以及其他生理活动都具有重要影响(Elliott, 1995)。应激反应是鱼类受到一个或多个外界环境因素的不良刺激作用所产生的非特异性反应(王国强等, 2009)。温度应激会对鱼类生长(杨健等, 2007; 张雅芝等, 2009)、行为(陈松波, 2004; Goyer et al, 2014)、生殖(张亚晨,2015)、免疫(Morvan et al, 1996; 何福林等, 2007)等造成影响，从而引起鱼类一系列生理生化指标的改变，如虹鳟(Oncorhynchus mykiss)在水温14℃～23℃下，红细胞数量随温度的升高而减少(向建国, 2008)；22℃下急性温度胁迫银鲳(Pampus argenteus)幼鱼48 h，其胃蛋白酶和胰蛋白酶的活力无显著变化(P＞0.05)，而二者在 32℃下的活力显著上升(P＜0.05) (施兆鸿等,2016)。热休克蛋白70 (Heat Shock Protein 70, HSP70)是鱼类温度应激中最重要的生理生化指标之一。

HSP70 是热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)家族中最为重要的一员，分子量约为70 kDa。遗传学家Ritossa 首次在果蝇(Drosophila)唾液腺中发现热休克蛋白(Ritossa, 1962)；除热休克外，细胞在低温、缺氧、重金属、营养缺乏等其他应激条件下，也有HSPs生成，因此，又被称为应激蛋白(Stress Protein, SP) (钟文英等, 2005)。HSP70 是目前鱼类中研究最广泛的一类热休克蛋白，许多鱼类的hsp70 基因序列已报道，如罗非鱼(Oreochromis mossambicus) (Molina et al,2000)、草鱼(Ctenopharyngodon idella) (林亚秋等,2009)、团头鲂(Megalobrama amblycephala) (明建华等,2009)、达氏鳇(Huso dauricus)(Peng et al, 2016)等。HSP70 具有重要的生物学功能，如分子伴侣功能、保护遗传物质DNA、增强细胞耐受能力等。作为分子伴侣，在高温下，HSP70 能协助变性蛋白复性(Heredia,2008)、保护生物体免受损伤(Deane et al, 2006; Rosic et al, 2011)。

杂交黄颡鱼(黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco ♀ ×瓦氏黄颡鱼Pelteobagrus vachelli ♂)“黄优1 号”是由华中农业大学等多家育种单位共同研发、经全国水产原种和良种审定委员会审定通过的我国淡水养殖鱼类新品种(品种登记号GS-02-001-2018)，其在相同养殖条件下，与母本黄颡鱼相比，1 龄鱼生长速度平均提高143.4%；与父本瓦氏黄颡鱼相比，品质和市场接受度提高。目前，尽管在国内已开展关于杂交黄颡鱼杂交育种及杂种鉴定等初步研究工作(王卫民, 2003;唐忠林等, 2016; 巩高瑞等, 2017; 张佳佳等, 2017)，但在抗逆方面的研究相对较少。本研究对杂交黄颡鱼hsp70 基因进行克隆、生物信息学分析、组织表达的同时，探究了温度应激对hsp70 基因组织表达的影响，为其抗逆、抗病选育奠定理论基础，也为其健康高效养殖提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

选取健康无病、规格整齐的杂交黄颡鱼30 尾，体长为(13.88±1.03) cm，采集于四川省眉山市东坡区缘通特种水产养殖场。

30 尾鱼随机分为4 组，每组6 尾，4 组鱼均暂养于48 cm×34 cm×25 cm 的养殖箱中，水深20 cm。设置4 个温度梯度，分别为20℃(常温组)、25℃、28℃和31℃，采用控温器控温(±0.5℃)，处理3 h 后麻醉，迅速取各组的肝脏、鳃、脑和肌肉，液氮速冻，–80℃超低温冰箱保存。

1.2 hsp70 基因核心序列的克隆

参照Total RNA Kit Ⅱ(Omega)提取杂交黄颡鱼总 RNA。1%琼脂糖凝胶电泳和 NanoDrop 2000(Thermo)检测 RNA 的完整性、浓度和纯度。参照PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)的步骤进行cDNA 的合成。

根据GenBank 中黄颡鱼的hsp70 cDNA 序列(登录号：KR673401.1)，设计引物(表1)扩增杂交黄颡鱼hsp70 基因核心序列。以杂交黄颡鱼cDNA 为模板进行PCR 扩增，PCR 体系参照2×TSINGKE®Master Mix(TSINGKE)。回收与纯化、测序，获得杂交黄颡鱼hsp70 基因核心序列。

表1 本实验所用的引物序列Tab.1 The primers used in the experiment

1.3 hsp70 基因组织表达

根据杂交黄颡鱼hsp70 的核心序列，设计qPCR引物(表1)。参照黄颡鱼组织表达相关研究(冯美惠等,2017; 张娟等, 2009)，获取内参基因β-actin 和18S rRNA 序列设计内参引物(表1)。提取杂交黄颡鱼肝脏、鳃、脑、肌肉的总RNA，反转录，采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)方法检测hsp70 基因mRNA 在肝脏、鳃、脑、肌肉中的相对表达量，计算方法为2–ΔΔCt(Livak et al, 2001)。

采用SPSS 22.0 进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，不同处理间进行Duncan’s 多重比较检验，显著水平取0.05。

2 结果

2.1 hsp70 基因核心序列分析

测序结果表明，从杂交黄颡鱼肝脏组织分离鉴定得到的hsp70基因片段大小为735 bp(图1)，通过NCBI上 的 ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)确定开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，ORF为729 bp，翻译得到编码243个氨基酸的蛋白质；于ExPASy-Protparam tool (https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)进行蛋白序列基本特征分析：氨基酸组成中，Leu(L)、Ala(A)和Ser(S)含量较高，分别为8.6%、8.6%和7.8%；酸性氨基酸(Asp+Glu) 27个，占11.1%；碱性氨基酸(Arg+Lys) 32个，占13.2%；其理论pI/MW为9.06/27251.28。

图1 杂交黄颡鱼hsp70 基因核心序列及推测的氨基酸序列Fig.1 Core cDNA and deduced amino acid sequences of hsp70 in the hybrid of P. fulvidraco ♀ × P. vachelli ♂

2.2 hsp70 基因核苷酸与氨基酸同源性分析

将克隆得到的杂交黄颡鱼hsp70 基因核苷酸与氨基酸序列分别于NCBI 上的 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行Nucleotide BLAST 和Protein BLAST。运用MegAlign 7.0 进行核苷酸与氨基酸同源性分析。结果显示(表2)，杂交黄颡鱼与6 种鱼类的 hsp70 基因核苷酸同源性为 80.2%～99.7%，氨基酸同源性为87.6%～99.6%，表明hsp70基因有较高同源性，该区段在进化中高度保守。图2详细列出了杂交黄颡鱼与以上6 种鱼类的hsp70 基因氨基酸序列的差异。

表2 杂交黄颡鱼hsp70 基因核苷酸与氨基酸同源性分析Tab.2 Homology analysis of nucleotide and amino acid sequences of hsp70 gene in the hybrid of P. fulvidraco ♀ × P. vachelli ♂(%)

图2 hsp70 基因氨基酸序列比对Fig.2 Alignment of amino acid sequences of hsp70 gene

2.3 hsp70 基因组织表达

以β-actin 和18S rRNA 为双内参基因，qPCR 分析hsp70 基因在20℃(常温组)杂交黄颡鱼不同组织中的相对表达量。结果显示(图3)，hsp70 基因在杂交黄颡鱼肝脏、鳃、脑、肌肉4 个组织均有表达，其表达量由高到低依次为肝脏、脑、鳃、肌肉。肝脏与脑、鳃、肌肉的表达量均差异显著(P＜0.05)，脑与鳃、肌肉的表达量差异显著(P＜0.05)，鳃与肌肉的表达量差异不显著(P＞0.05)。

图3 杂交黄颡鱼hsp70 基因在不同组织中的相对表达量Fig.3 Relative expression of hsp70 gene in different tissues of the hybrid of P. fulvidraco ♀ × P. vachelli ♂

2.4 hsp70 基因在温度应激下组织表达分析

温度应激实验qPCR 结果显示(图4)，25℃、28℃和31℃下，hsp70 基因的表达量由高到低依次均为鳃、肝脏、脑、肌肉，且28℃、31℃下hsp70 基因于鳃中的表达量与肝脏、脑、肌肉中的表达量差异显著(P＜0.05)；而25℃下，hsp70 基因于鳃中的表达量与肝脏中的表达量差异不显著(P＞0.05)，但与脑、肌肉中的表达量差异显著(P＜0.05)。

肝脏中hsp70 基因的表达量随温度的升高先上升后下降，28℃时达到最大值，表达量显著高于20℃、25℃和31℃下的表达量(P＜0.05)；鳃中，hsp70 基因的表达量随温度的升高而不断上升，31℃时达到最大值，28℃和31℃下的表达量显著高于20℃和25℃下的表达量(P＜0.05)，说明温度应激对杂交黄颡鱼hsp70基因在鳃中的表达量影响大；脑中，hsp70 基因的表达量随温度的升高先上升后下降，28℃时达到最大值，且28℃下的表达量与20℃、25℃和31℃下的表达量差异显著(P＜0.05)；肌肉组织中，hsp70 基因的表达量随温度的升高逐渐上升，31℃时达到最大值，31℃下的表达量与20℃、25℃和28℃下的表达量差异显著(P＜0.05)。

图4 不同温度下杂交黄颡鱼hsp70 基因在不同组织中的相对表达量Fig.4 Relative expression of hsp70 gene in different tissues of the hybrid of P. fulvidraco ♀ × P. vachelli ♂at different temperatures

3 讨论

鱼类是变温脊椎动物，温度的日变化和季节变化对鱼的生命过程有重要影响，水环境的其他因素(如重金属、缺氧、细菌感染等)也影响着鱼类的分布和生理状态，而这些因素与它们体内热休克蛋白的数量和表达程度息息相关。HSPs 在生物界普遍存在，在同一生物体的不同组织内均有表达(曲凌云等, 2004)。本研究通过qPCR 的方法检测了hsp70 在杂交黄颡鱼不同组织中的相对表达量，结果表明(图3)，hsp70基因在肝脏、鳃、脑、肌肉具有明显的组织特异性，肝脏中的表达量显著高于脑、鳃、肌肉中的表达量，这可能与肝脏在动物消化、代谢、免疫、内环境的调节等方面都具有十分重要的作用有关。hsp70 的组织特异性表达在草鱼(林亚秋等, 2009)、淞江鲈(Trachidermus fasciatus) (刘庆全, 2013)、达氏鳇(Peng et al, 2016)中均有报道，但相对表达量和组织间表达水平存在差异：如草鱼的各组织间的表达量由高到低依次为脑、肝胰脏、鳃、肌肉，且脑与肝胰脏、鳃、肌肉的表达量差异显著(P＜0.05) (林亚秋等, 2009)；淞江鲈hsp70 基因在鳃、脑、肌肉、肝脏中的表达量依次递减(刘庆全, 2013)。可能原因有物种的差异性及实验温度设置的不同，温度变化对hsp70 在不同的组织中会产生不同的响应(Peng et al, 2016; 王云彪,2008; 万文菊, 2006)。

温度应激实验研究不同温度下杂交黄颡鱼hsp70基因在不同组织中的表达水平。20℃～31℃，随着温度的升高，hsp70 基因在不同组织中均呈先上升趋势，表明hsp70 基因在保护机体免受损害中发挥作用，其中，鳃和肌肉中的表达量呈持续上升的趋势；而在肝脏和脑中的表达量呈先上升后下降的趋势，28℃到达峰值。鳃、肌肉和肝脏中的变化趋势与草鱼hsp70 对温度响应的变化(周鑫等, 2013)趋势一致。脑中的变化趋势与鲤鱼(Cyprinus carpio)的应激实验中10℃～28℃的变化趋势(王云彪, 2008)一致，均呈不断上升的趋势。此外，西伯利亚鲟(Acipenser baerii)进行急性热应激，鱼体从17.5℃迅速转至27.5℃后，hsp70 于鳃和脑中的表达量均呈上升趋势(田照辉等, 2013)，这也与本研究结果相符。

hsp70 具有广泛的运用前景，可作为生物指标诊断鱼类的生理状态(Dunlap et al, 1997; Vijayan et al,1997)、生物标记物与水环境监测(De, 1996; 沈骅等,2004)，而作为生物标志物在生理学上的合理性即是基于HSP70 家族的诱导模式，即细胞内HSP70 表达水平可作为机体“温度计”的功能(Ge et al, 2002)。HSP70 对温度极为敏感，已被用作分子标记分析生物对温度等环境变化的响应(Mukhopadhyay et al,2010)。研究表明，急性温度应激会显著改变尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)幼鱼肝脏HSP70 的表达，其表达量基本呈先上升后下降的趋势(强俊等, 2012)；而银鲫(Carassius auratus gibelio)热应激2 h 后，肝脏中hsp70 表达量达到最高(P＜0.01) (周朝伟, 2018)。hsp70 在不同组织对温度应激的响应不同，本研究中，杂交黄颡鱼的鳃组织对温度的响应最为敏感，鳃为杂交黄颡鱼温度应激的敏感组织，可能是鳃作为鱼类呼吸代谢的重要器官，hsp70 表达量升高是鱼类在温度急剧变化情况下的一种机体保护策略。hsp70 基因家族存在亚型 hsc70 基因，目前国内有开展黄颡鱼HSC70 表达(张娟, 2009)的相关研究，25℃下HSC70在所检测的组织中均有表达，且表达量在鳃中最高，在肌肉中最低，这与杂交黄颡鱼在25℃下HSP70 的组织表达结果一致，进一步表明HSP70 基因家族对黄颡鱼的鳃在温度应激下产生的免疫应答对机体保护具有重要作用。

研究表明，氧限制的热耐受性理论(Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance, OCLTT) (Pörtner et al,2001、2008)可适用于淡水广温性鱼类(周鑫等, 2013)，根据该理论：当环境温度超过生物体最适温度时，有氧代谢会下降，随着温度进一步上升，将导致有氧代谢丧失，转变为无氧代谢，氧自由基和变性蛋白相应增加，影响免疫应答及诱导热休克蛋白的表达。由于热休克蛋白的表达需要消耗能量，其只能提供短期保护(Pörtner et al, 2001、2007)。基于hsp70 的表达量，后期可开展杂交黄颡鱼耗氧率和半致死温度的实验，以确定杂交黄颡鱼的生理临界温度。这将为杂交黄颡鱼抗逆、抗病选育奠定理论基础，也为其健康高效养殖提供理论指导。

致谢：感谢四川农业大学生命科学学院杜小刚副教授和李云坤博士研究生，感谢四川农业大学动物科技学院银龙硕士、张月硕士、张松培硕士和苗懿硕士研究生，感谢四川大学生命科学学院黎树博士研究生及眉山伟继水产种业科技有限公司张继业总经理等在实验过程中给予的指导和帮助！