夏闲期种植翻压绿肥作物对麦田土壤细菌多样性的影响

吕卓呈，李廷亮，2，谢英荷，2，李 顺，王嘉豪

（1.山西农业大学资源环境学院，山西太谷 030801；2.山西农业大学资源与环境国家级实验教学示范中心，山西太谷 030801）

绿肥作为一种养分丰富的生物肥料，在目前我国化肥零增长计划以及土壤有机质提升战略中，是一种重要的化肥替代肥源[1]。绿肥腐解过程中养分的释放过程缓慢，可满足作物生长过程养分的逐步需求，不仅能有效提高作物产量和养分利用效率，还可以降低养分淋溶损失的风险[2]。绿肥在微生物作用下产生大量腐殖质，增加了土壤中水稳定性团粒结构数量，起到改善土壤通气、保水和保肥等作用，也能为土壤微生物代谢提供大量碳源和氮源，使土壤细菌Shannon 指数与Simpson 指数明显提高，改变了土壤细菌多样性以及群落组成，促进了细菌对固有有机质的分解和利用，从而使土壤的有机质处于一个动态平衡和不断更新的过程中[3]。

我国绿肥资源丰富，已发现禾本科、豆科、十字花科、苋科等10 个科共计1 000 多个绿肥作物。我国不同生态种植区由于气候环境条件差异，适宜种植的绿肥作物种类不一，但大量研究表明，种植翻压绿肥对提升土壤养分含量和微生物多样性均具有积极促进作用[4]。林叶春等[5]研究表明，种植翻压绿肥能够使土壤全氮、水解氮和有机质含量增加，且土壤pH 值也随之发生改变，其中，土壤pH 值和有机质含量对于土壤细菌群落结构变化具有重要影响。万水霞等[6]在安徽双季稻种植区研究表明，种植翻压紫云英配施化肥7 a 后，土壤微生物数量显著增加了58.09%～86.86%，其中细菌数量增加了77.93%～112.76%。张珺穜等[7]研究表明，在水稻土种植紫云英并翻压还田还可以显著提高土壤放线菌、氨化细菌和纤维素分解菌数量。高嵩涓等[8]研究表明，种植翻压紫云英可提高土壤微生物量碳和土壤微生物量氮含量，晚稻收获后相对冬闲分别提高了21.12%和98.45%，全年平均值分别提高了15.92%和36.49%。陈晓波等[9]在云南红壤烟草地研究表明，种植翻压光叶紫花苕增加了土壤细菌、放线菌数量，变化差异均达到显著水平（P＜0.05）。另外，通过对马铃薯和绿肥轮作的研究发现，轮作增加了土壤革兰氏阳性细菌和真菌的多样性，导致土壤微生物群落的改变，从而增加了土壤微生物活性[10]。综上，绿肥对土壤微生物特征影响的研究多集中在水稻和烟草种植区，而在黄土高原旱作麦区的报道相对较少。通过研究种植并翻压绿肥对土壤细菌群落结构的变化，探讨绿肥腐解养分释放过程的微生物机制，有助于在黄土旱塬麦区构建系统完整的绿肥生产体系。

黄土高原一年一作的旱地冬小麦种植区，每年的7—9 月是冬小麦夏闲期，也是当地的水热资源丰沛期，期间种植翻压绿肥作物对提高土壤肥力和小麦产量具有重要意义，但目前有关旱地冬小麦夏闲期适宜绿肥作物种植研究相对较少。本研究从土壤微生物代谢角度，利用高通量测序技术分析了旱地冬小麦夏闲期种植翻压不同绿肥作物对土壤细菌多样性及其功能的影响，以期为该区域旱地土壤培肥和适宜绿肥作物筛选提供一定依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验地位于黄土高原东南部的山西省临汾市洪洞县冬小麦种植区（36.3°N，111.4°E，海拔648 m）。试验区属于温带大陆季风性气候，四季干湿冷暖分明，年平均日照时数2 491 h，积温3 300 ℃，无霜期180～210 d，年平均降水量500 mm 左右，60%～70%集中在6—9 月，为典型旱地雨养农业区。供试土壤类型为石灰性褐土，质地为中壤。试验田0～20 cm土壤基本理化性质为：有机质含量14.6 g/kg，全氮含量0.87 g/kg，硝态氮含量10.4 mg/kg，铵态氮含量12.2 mg/kg，速效磷含量10.4 mg/kg，速效钾含量168.2 mg/kg，阳离子交换量27.3 cmol/kg。

1.2 试验材料

供试大豆品种为晋豆47 号，绿豆品种为中绿1 号，由优种网（北京）商贸有限公司提供；供试黑豆为小黑豆，品种未知，由洪洞县农业农村局提供；供试乌豇豆为农民自留种，品种未知；供试草木樨品种为库明诺（Cumino）黄花草木樨，柽麻品种为皖柽1 号，由北京正道生态科技有限公司提供。

1.3 试验设计

2019 年在旱地冬小麦夏闲期（6—9 月）种植6 种豆科绿肥作物，分别为黑豆（GL）、绿豆（VW）、乌豇豆（VS）、大豆（GM）、柽麻（CJL）、草木樨（MP），以农户传统休闲模式为对照（CK）。小区面积42 m2（6 m×7 m），采用随机区组设计，每个处理3 个重复。绿肥的播种时间为2019 年7 月11 日，各小区绿肥作物基本苗保证在30.0 万～37.5 万株/hm2，绿肥粉碎翻压时间为2019 年9 月20 日，绿肥翻压后于2019 年10 月20 日播种冬小麦。

1.4 样品采集与制备

于2019 年11 月15 日在黑豆、绿豆、乌豇豆、柽麻、草木樨、大豆和对照处理对应的小区，用5 点法采集耕层土壤（0～20 cm）样品，将每个小区的土壤混合样品置于密封性较好的无菌自封袋中放入保温箱中，用冰袋冷藏带回实验室。土壤样品过2 mm 筛，混匀后取部分土壤样品于无菌离心管中，在-80 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.5 土壤细菌群落结构分析

将过2 mm 筛的鲜土经-80 ℃低温处理后，干冰储藏送往北京奥维森基因科技有限公司进行基于细菌16S rDNA 的高通量测序分析，用正向338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和反向806R（5′-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）的通用引物扩增细菌16SrRNA基因的V3-V4 区。PCR 采用Trans-Gen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase。每个样本3 个重复，将同一样本的PCR 产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR 产物，Tris HCl 洗脱，2%琼脂糖电泳检测。采用Qiime 软件对高通测序结果进行有效化处理和Alpha-多样性指数分析，并对97%相似水平下的OTUs（Operational Taxonomic Units）进行基于Silva 数据库的分类学分析。

1.6 数据分析

采用Excel 和R 语言对高通测序数据进行统计分析后，绘制花瓣图及PCA 分析。

2 结果与分析

2.1 种植翻压绿肥后土壤Illumina 测序结果

不同处理土样Illumina MiSeq 高通量测序结果如表1 所示。

表1 样品序列数统计

由表1 可知，7 个处理共获得1 649 541 条序列，过滤掉低质量的序列，优化后得到1 611 976 条序列。统计各个样品在不同OTU 中的丰度信息，共产生40 136 个OTU。各处理的序列优质率均在97%以上。各绿肥处理的OTU 数量均高于农户模式，增幅在2.3%～8.8%，具体表现为草木樨＞绿豆＞柽麻＞大豆＞黑豆＞乌豇豆＞农户。

从图1 可以看出，各绿肥处理与农户模式的共有OTU 数量为3 754，农户模式特有的OTU 数量为1 706，绿肥处理中特有的OTU 数量以草木樨最高，为2 185；以乌豇豆最低，为1 834。

2.2 种植翻压绿肥后土壤细菌Alpha-多样性分析

Alpha-多样性分析包括一系列统计学分析指数，可以反映微生物群落的丰度和多样性。从图2可以看出，Chao1 指数为菌种丰富度指数，各绿肥处理的Chao1 指数均高于农户模式，增幅为0.1%～7.1%（P＜0.05），其中，草木樨和绿豆处理的Chao1指数显著高于农户休闲对照。Observed species 表示随测序深度的增加实际观测到OTU 的个数，本试验中绿肥处理的Observed species 值较农户模式均有不同程度的提高，其中，草木樨和绿豆处理的Observed species 值较高，分别较农户模式高8.1%和8.0%（P＜0.05）。PD whole tree 指数是谱系多样性指数，兼顾了物种丰度及群落多样性，不同处理的谱系多样性指数同样以草木樨和绿豆处理最高，较农户模式分别高10.1%和9.1%（P＜0.05）。Shannon 指数是对群落结构的综合反映，其值的大小可以说明群落多样性的高低，各绿肥处理的Shannon 值较农户模式高0.5%～2.2%（P＜0.05），其中以绿豆处理的Shannon 指数最高。从Alpha-多样性总体来看，不同处理之间土壤微生物多样性表现为绿豆＞草木樨＞大豆＞柽麻＞黑豆＞乌豇豆＞农户。

2.3 种植翻压绿肥后土壤细菌群落组成主成分分析

主成分分析（Principal component analysis，PCA）可以用来分析土壤微生物的OTU 组成差异。由图3可知，第1 主成分贡献率达30.44%，第2 主成分贡献率达18.74%，因子1 和因子2 代表总变量的49.18%。以这2 个主成分为坐标轴构建的二维坐标系中，各个处理在PC 轴上存在差异，说明不同绿肥处理中土壤细菌群落的结构特征存在明显差异。绿豆（VW）和草木樨（MP）处理分布在第1 象限，乌豇豆（VS）处理分布在第2 象限，农户传统模式（CK）和黑豆（GL）处理分布在第3 象限，柽麻（CJL）、大豆（GM）处理分布在第4 象限。可知，种植草木樨与种植绿豆的土壤细菌群落组成相似，大豆与柽麻处理的土壤细菌群落组成相似，黑豆与农户传统模式的土壤细菌群落组成相似，乌豇豆与其他处理的土壤细菌群落组成差异较大。

2.4 土壤细菌群落组成分析

Illumina MiSeq 高通量测序获得的数据在97%相似水平上进行分类。经过高通量测序和OTU 注释，本试验检测出细菌共40 门130 纲212 目374 科652 属。

2.4.1 细菌在门水平上的群落组成 由图4 可知，所有样品共检测出放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）等12 个门类的细菌（相对丰度大于1%）。其中，酸杆菌门（21.4%～31.8%）、放线菌门（18.6%～26.1%）、变形菌门（16.1%～23.7%）的相对丰度之和在7 个处理中均占到细菌总量的65%以上，为优势菌门。绿弯菌门（Chloroflexi，10.5%～15.7%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，4.8%～7.4%）和拟杆菌门（Bacteroidetes，2.9%～4.9%）为次级优势菌门。除乌豇豆处理，其他绿肥处理较农户模式均增加了土壤中变形菌门细菌的相对丰度，乌豇豆处理更有利于土壤中酸杆菌门和绿弯菌门细菌相对丰度的增加，各绿肥处理的放线菌门细菌相对丰度则较农户模式均有不同程度的降低。

2.4.2 细菌在纲水平上的群落组成 本试验得到的土壤细菌分属130 个纲，Other 指平均丰度小于0.4%的细菌。从纲的分类水平上看（图5），纲水平细菌丰度大于1%的有27 种，优势纲类（相对丰度＞3.0%）有10 种，包括Subgroup_6、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、放线菌纲（Actinobacteria）、Blastocatellia、嗜热油菌纲（Thermoleophilia）、芽单胞菌纲（Gemmatimonadetes）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）和酸微菌纲（Acidimicrobiia）。不同处理间，除乌豇豆处理外，其他绿肥处理较农户处理均提高了α-变形菌纲、β-变形菌纲和δ-变形菌纲相对丰度，乌豇豆处理则较其他处理提高了土壤中Subgroup_6、Blastocatellia 细菌的相对丰度，各绿肥处理放线菌纲、嗜热油菌纲（Thermoleophilia）相对丰度较农户模式有不同程度的降低。

3 讨论

土壤细菌作为土壤中最重要的活性组分，其多样性水平是反映土壤质量变化的最重要指标[11-12]。本研究中，不同绿肥处理土壤细菌OTU 数量及Alpha-多样性指数的变化趋势相同，土壤细菌多样性和丰富度较农户模式均有所增加，与李文广等[13]在黄土高原旱区的研究结论一致，将绿肥合理还田对于土壤细菌群落多样性有明显的改善作用。另LONGA 等[14]研究也发现，绿肥是土壤微生物多样性的主要来源，种植翻压绿肥后，土壤细菌Alpha-多样性指数都有所增加。

本研究中，绿豆和草木樨处理的土壤细菌群落组成相似，柽麻和大豆处理的土壤细菌群落组成相似，而乌豇豆与农户传统模式处理的细菌群落组成相似，与其他绿肥处理差异较大。种植乌豇豆的土壤细菌群落变化总是与其他5 种绿肥处理呈相反趋势或更极端趋势，对于这一结果的影响机理，仍需深入研究。

土壤细菌群落在门、纲分类水平上的物种组成分析显示，本试验条件下酸杆菌门、放线菌门、变形菌门平均细菌相对丰度之和占到细菌总量的68%以上，为优势菌门。刘爽等[15]在黄土高原半干旱区和沙区的研究发现，土壤细菌在门水平上的优势菌门分别为变形菌门、放线菌门和酸杆菌门，相对丰度分别为21.4%～23.0%、18.7%～23.0%和17.5%～19.9%，与本试验结果一致。王伏伟等[16]也有相似的研究结果，砂姜黑土中细菌类群丰富，优势细菌门为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门和拟杆菌门，其中，变形菌门相对丰度最大，为38.5%～43.2%。徐冰等[17]、SAPP 等[18]、LIU 等[19]的研究结果也与本试验结果一致。还有研究表明，酸杆菌存在于各种生境，其数量一般约占细菌总量20%～50%，对土壤生态系统的构建具有重要作用[20-24]。

在本研究中，各绿肥处理的放线菌门细菌相对丰度则较农户模式均有不同程度的降低。刘平静等[25]在关中平原麦区的研究发现，有机肥配施化肥处理降低了土壤放线菌门的相对丰度。这可能是在有机物质分解过程中产生的一些中间产物会抑制放线菌门细菌的生长，也可能与绿肥翻压后土壤C/N 改变有关。本研究中乌豇豆处理较其他处理提高了土壤中Subgroup_6、Blastocatellia 的相对丰度，且所有处理中Subgroup_6 丰度的变化与酸杆菌门的丰度变化趋势一致，说明Subgroup_6 是导致酸杆菌门丰度发生变化的主要原因。

变形菌门为细菌中最大的一个门，变形菌门属于需营养类群，对易分解的碳源反应敏感[26]，其相对丰度通常随着土壤氮素和有机质含量的增加而增加[27]。本研究中，种植翻压黑豆、大豆、绿豆、柽麻、草木樨均提高了变形菌门的丰度，可能是绿肥还田为变形菌门提供了丰富的有机养分，而种植翻压乌豇豆并没有提高变形菌门丰度，且存在一定抑制作用，具体原因有待进一步研究。

4 结论

本研究表明，冬小麦夏闲期种植翻压绿肥可增加土壤细菌的OTU 数量，不同绿肥作物之间具体表现为草木樨＞绿豆＞柽麻＞大豆＞黑豆＞乌豇豆＞农户对照，且种植翻压草木樨和绿豆较其他绿肥作物更有利于提高土壤细菌的Chao1、Observed species、PD whole tree 和Shannon 指数，提高了土壤细菌丰度和多样性。主成分分析表明，种植翻压草木樨和绿豆的细菌群落组成相似，而种植翻压乌豇豆与其他绿肥处理土壤细菌群落组成差异较大。在细菌分类的门水平上，乌豇豆处理有利于土壤中酸杆菌门和绿弯菌门细菌相对丰度的增加，而其他绿肥作物更有利于土壤中变形菌门细菌的相对丰度的增加；在细菌分类的纲水平上，乌豇豆处理有利于提高了土壤中Subgroup_6、Blastocatellia 细菌的相对丰度，其他绿肥处理可提高土壤中α-变形菌纲、β-变形菌纲和δ-变形菌纲细菌的相对丰度。各绿肥处理的放线菌门细菌相对丰度较农户模式均有不同程度的降低。综上，本研究条件下，冬小麦夏闲期种植翻压绿豆和草木樨可有效改善旱地麦田土壤细菌群落结构和多样性，对土壤培肥改良起到一定作用。