唐雪峰,张蝶,张磊
1 天津市第三中心医院,天津300170;2天津市重症疾病体外生命支持重点实验室;3 天津市人工细胞工程技术研究中心;4天津市肝胆研究所
胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一,是源于上皮细胞的一种肿瘤,恶性度高,易转移。世界范围内东亚地区发病率最高[1]。经常食用腌制品、幽门螺杆菌感染是罹患胃癌的高危因素[2]。对于早期胃癌患者,手术是最佳的治疗策略,但部分患者发现时已处于晚期或伴有转移,需化疗和靶向治疗[3]。微小RNA(miRNA)是一类长度约为22 个核苷酸的内源性非编码RNA,具有调控基因表达的重要作用[4]。miRNA 在多种癌症中均有异常表达,如结直肠癌、肝癌[5],表明miRNA 与癌细胞的增殖、分化、转移及预后有关。近年来,关于miR-663 的研究报道逐渐增多。研究显示,miR-663 在甲状腺乳头癌中呈异常表达,在癌症发展中发挥抑制作用[6];亦有研究显示,miR-663具有促进癌细胞增殖分化的作用[7]。目前,miR-663 在胃癌发生发展中的作用机制尚不清楚。人白细胞抗原-G(HLA-G)是一种主要组织相容性复合体(MHC),当体内有炎症时,HLA-G 便以可溶性人类白细胞抗原-G(sHLA-G)形式出现于外周血中,进而对机体内环境进行调节[8]。研究表明,sHLA-G在甲状腺癌发展中发挥重要作用,并与疾病的侵袭性有关[6],但两指标在胃癌中的具体作用机制报道较少。2017 年3 月—2019 年8 月,我们检测了胃癌患者血清中miR-663、sHLA-G 的表达并探讨其临床意义。
1.1 临床资料 选取2017 年3 月—2019 年8 月于天津市第三中心医院住院治疗的胃癌患者82例(胃癌组),其中男56 例、女26 例,年龄45~64(50.39 ±2.41)岁,其中≥50岁37例,<50岁45例。纳入标准:①患者经病理检查明确诊断为胃癌;②患者均为首次诊断胃癌,未接受过任何方式的抗肿瘤治疗;③本研究经天津市第三中心医院伦理委员会批准,血液标本的采集和临床资料收集均获得受检者本人知情同意。排除标准:①患有其他系统恶性肿瘤者,如肺癌、肝癌等;②有免疫功能缺陷者;③并发全身感染性疾病者。TNM 分期及病理分化程度参考第8版美国癌症联合会标准[9]。组织分化程度为中低分化51例,高分化31 例;TNM 分期:Ⅰ期44 例,Ⅱ期24 例,Ⅲ期8例,Ⅳ期6例;有淋巴结转移32例;肿瘤直径<2.5 cm 48 例,≥2.5 cm 34 例。另选同期在院体检健康的志愿者50 例作为对照组,男30 例、女20 例,年龄47~65(45.24±2.06)岁。本研究通过医院伦理委员会批准,患者或其家属签署知情同意书。
1.2 血清中miR-663、sHLA-G 表达检测 所有受试者晨起空腹抽取静脉血约4 mL,加入到EDTA 抗凝管中,3 000 r/min 离心10 min,离心半径12 cm 分离血清。应用TRIzol 法提取总RNA(RNA 提取试剂盒购自Invitrogen 公司),使用紫外分光光度仪检测RNA 浓度,符合标准的RNA 冻存备用。使用RNA逆转录试剂盒(购自日本TaKaRa 公司)将提取出的RNA 进行反转录成cDNA,以cDNA 为模板,使用PCR扩增试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)进行PCR 扩增。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成,miR-663 正向引物:5'-CAGGATGAGA‑CATGAGGCCA-3',反向引物:5'-CTCTCGTGCTGC‑CATACCTGAT-3'。内参基因U6 作为对照,U6 正向引物:5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3',反向引物:5'-CAAAGTTGTCA-TGGATGATCC-3'。反应体系:10 μL 2×SYBR Green,1 μL 20×TaqDNA 聚合酶,1 μL 正反向引物和8 μL H2O。qPCR 反应条件:95 ℃预变性5 min,55 ℃变性1 min,72 ℃延伸10 s,共40 个循环。每个样本至少重复3 次试验,最后采集荧光信号,结果以2-ΔΔCt计算和标准化miR-663 的相对表达量。采用ELISA法检测各组血清中sHLA-G的浓度(试剂盒购于上海生工生物工程有限公司),操作步骤按照试剂盒的说明书逐步进行。
1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量数据以±s表示,两组间比较采用两独立样本t 检验或校正t 检验。应用Pearson 相关检验分析miR-663、sHLA-G 与胃癌发生的关系。应用受试者工作特征(ROC)曲线评价miR-663 与sHLA-G 对胃癌的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 胃癌组与对照组miR-663、sHLA-G 表达比较 胃癌组与对照组血清miR-663 相对表达量分别为2.604±0.712、7.113±1.205,sHLA-G 水平分别为(41.851±1.426)、(8.458±1.148)ng/mL,胃癌组血清中miR-663 表达低于对照组(P<0.05),sHLA-G表达高于对照组(P<0.05)。
2.2 miR-663、sHLA-G 表达与胃癌发生的关系Pearson 相关分析结果显示,miR-663 与胃癌发生呈负相关(r=-0.922,P<0.01),sHLA-G 与胃癌发生呈正相关(r=0.997,P<0.01)。
2.3 胃癌组血清中miR-663、sHLA-G 表达与患者临床病理特征的关系 胃癌组血清miR-663、sHLA-G表达与肿瘤TNM 分期、分化程度、淋巴结转移有关(P 均<0.05),与年龄、性别及肿瘤直径无关(P 均>0.05)。见表1。
2.4 血清中miR-663 与sHLA-G 对胃癌的诊断价值 ROC 曲线分析显示,血清miR-663、sHLA-G 表达对胃癌有较高诊断价值,曲线下面积(AUC)分别为0.793、0.855,理论阈值分别为4.8、25 ng/mL,灵敏度分别为0.825、0.843,特异度分别为0.741、0.857,约登指数分别为0.566、0.690。两者联合应用诊断效能提高,敏感度和特异度分别为0.878、0.860,约登指数为0.738。
表1 胃癌组血清miR-663、sHLA-G表达与患者临床病理参数的关系
胃癌是全球性的恶性肿瘤,全世界每年新发胃癌患者约100万例,约7万例死亡[10]。近年胃癌发病率有所降低,但仍有部分患者被诊断为胃癌晚期,且80%的患者由于癌细胞的转移而导致死亡[11]。胃癌的主要治疗手段有手术切除、放疗及化疗或靶向治疗。因早期胃癌临床症状不明显,易被忽略而耽误病情。
miRNA 是一种单链非编码RNA 分子,能对靶基因转录后表达进行调控[12]。截至目前,在植物、动物甚至病毒基因组中已发现数百种miRNA。miRNA通过与mRNA 序列的3'-非翻译区(UTR)结合,进而导致mRNA 降解或抑制其翻译功能[13]。研究表明,miRNA 在肿瘤发生过程中发挥重要作用,如促进癌细胞的增殖、侵袭及转移[12]。miR-663 是miRNA 家族的成员之一,在多种肿瘤疾病中均有异常表达,如甲状腺癌、胰腺癌[14],在胃癌中研究较少。据报道,低表达的miR-663 可通过抑制上皮细胞间质转化过程从而对肿瘤细胞的生长起抑制作用[14]。本研究结果表明,胃癌组血清中miR-663 相对表达量低于对照组,差异有统计学意义,且与胃癌的发生呈负相关,说明miR-663 参与胃癌病变的发生。可能是过表达的miR-663靶向下调TGF-β1表达进而影响其翻译功能,从而在肿瘤发生发展过程中起到抑制作用。当miR-663 表达降低时,其对下游靶基因的抑制作用减弱,间接促进其翻译过程,促进肿瘤细胞的增殖分化,提高肿瘤的恶性程度及临床分期[14]。本研究结果还显示,miR-663 的相对表达量与细胞分化程度、TNM 分期及淋巴结转移有关。研究表明,miR-663 通过下调靶基因PUMA/BBC3 及BTG2 表达影响线粒体的外膜通透性,从而抑制肿瘤细胞生长,加速癌细胞的凋亡,抑制肿瘤进展。胃癌组血浆miR-663 表达降低,其抑制癌细胞生长功能降低,癌细胞的凋亡数量减少,癌细胞的增殖、分化及侵袭转移促进,肿瘤恶性程度进一步升高[15]。此外,低表达的miR-663 可靶向调节p21(WAF1/CIP1)表达,使p21 基因的肿瘤抑制作用减弱,并协调细胞的生长周期、DNA 修复过程,促进癌细胞的增殖,加速肿瘤的恶性进展。
HLA-G 是一种低多态性的分子(已鉴定出51个等位基因),由α 链非共价结合β2微球蛋白构成[16]。HLA-G 主要在调节性T 细胞和内皮细胞中表达,其主要功能是通过与NK 细胞抑制受体(KIR2DL 或ILT-2)相互作用调节免疫反应[16]。研究显示,卵巢癌组织中HLA-G 表达上调,在卵巢癌的发生发展中发挥促进作用[17]。sHLA-G 是一种可溶性的HLA-G分子,其在胃癌发生发展中的作用机制尚不清楚。本研究结果表明,胃癌组血清sHLA-G 水平高于对照组,差异有统计学意义,且与胃癌的发生呈正相关。其机制可能是sHLA-G 异常升高,使得肿瘤细胞逃避免疫系统的监视,促进肿瘤细胞的增殖,减少凋亡细胞数量,加速肿瘤细胞的浸润、转移过程,从而加速肿瘤的恶性进展[18]。本研究结果还显示,sH‑LA-G 水平与分化程度、TNM 分期及淋巴结转移有关。sHLA-G 可刺激PI3K/Akt/mTOP 信号通路,从而抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤发生发展[17,19]。此外,过高sHLA-G 可抑制免疫细胞T 细胞、NK 细胞的功能,为肿瘤细胞的生长提供良好环境,使得机体对肿瘤细胞的免疫杀伤功能受抑,最终促进胃癌的发生发展[20]。高水平的sHLA-G 能直接抑制自然杀伤细胞、T 细胞的功能,为胃癌的形成、发展及转移创造免疫抑制微环境,从而妨碍机体对肿瘤免疫监视并抑制机体抗肿瘤的免疫杀伤效应,最终促进胃癌的发生发展。此外,本研究ROC 曲线分析显示,二者均能有效诊断胃癌,且联合应用诊断胃癌时,其诊断价值较单独应用时高。
综上所述,胃癌患者血清中miR-663 表达降低、sHLA-G 水平升高,且与肿瘤TNM 分期、细胞分化程度、淋巴转移有关,可作为胃癌诊断分子标志物。但本研究为回顾性分析,样本量较小,且未动态检测,确切结论需进一步研究证实。