杨树种质SSR指纹数据库构建

刘超凡，张国君，徐刚标

（1.中南林业科技大学 林学院，湖南 长沙 410004；2.湖南省泰格林纸集团有限公司，湖南 岳阳 414000）

杨树Populus具有适应性广、生长快、轮伐期短、产量高、易于更新的特点，是世界中纬度平原地区栽培面积最大、产量最高的速生用材树种之一[1-2]。由于天然条件下杨树种间极易产生自然杂种，以及各地频繁交流种质材料，极易引起其种质混杂[3]。植物种质准确鉴定，是保证其纯度的重要基础，也是杨树新品种知识产权保护、种质保存和利用的重要前提条件[4]。

早期的杨树种质资源遗传评价与鉴定，主要是利用其生物学特性、形态特征、适应性与抗性等方面的差异。由于杨树无性系种质间的生物学特性差异极小，形态特征极易受季节和环境因子影响，因此采用传统方法鉴定杨树无性系种质材料和新品种知识产权的保护具有一定的难度[4]。近30年来，随着现代分子生物学技术的快速发展，各种分子标记技术已广泛应用于杨树种质鉴定与资源评价研究[5-13]。特别是近年来基于荧光测序技术建立的TP-M13-SSR（Simple sequence repeat with tailed primer M13）检测技术，具有通量高、分辨率高和分子数据自动统计、成本低廉等优点[14]，已经广泛应用于农作物、果树及林木种质鉴别与指纹图谱数据库构建[15-20]。

本研究以泰格林纸集团有限责任公司在湖南省岳阳市建立的国家杨树种质资源库中部分谱系清楚的杨树无性系种质为研究材料，利用TP-M13-SSR 技术构建杨树无性系种质指纹图谱数据库，旨在快速鉴别林业生产上杨树优良无性系的真伪，为杨树新品种的知识产权保护提供依据，并为杨树杂交育种工作的亲本选择提供遗传学背景。

1 材料与方法

1.1 材 料

分别于2018年4月和2019年4月，从泰格林纸集团有限责任公司在湖南省岳阳市建立的国家杨树种质资源库中采集谱系清楚的141 份杨树无性系种质材料。将野外采集的新鲜幼嫩叶片，装入盛有硅胶的自封塑料袋中，带回实验室充分干燥后，置于4℃冰柜中保存。

1.2 方 法

1.2.1 DNA 提取

采用改良CTAB 法提取杨树基因组DNA[4]。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的完整性，核酸蛋白分析仪检测DNA 的浓度和质量。检测合格的DNA 稀释至浓度为50 ng·μL-1，置于-20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 SSR 引物筛选

从已报道的杨树SSR 引物[4,13]序列中，选取扩增产物片段长度在100～300 bp 之间的引物86对，用8 份遗传背景差异较大的无性系材料进行筛选，从中选出多态性高、条带清晰且稳定性好的14 对SSR 引物。

1.2.3 PCR 扩增体系

在选取的SSR 引物5′端，加上M13（TGTAAAACGACGGCCAGT）接头，构建TPM13-SSR 引物，M13 引物采用3 种荧光（ROX、HRX 和FAM）标记。SSR 引物及M13 荧光标记由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。TPM13-SSRPCR 反应体系及扩增程序参考文献[4]。采用毛细管自动荧光电泳系统ABI3730XL 对PCR扩增产物进行检测、分型。

1.2.4 数据分析

采用GeneMarker V1.91 软件进行基因分型，Cervus 3.0.7 软件估算多态信息含量（PIC）和各SSR 位点无效等位基因（Null alleles）频率（pN），POPGENE 3.2 软件统计、估算各SSR 位点上的等位基因数目（Number of allele，Na）、Shannon 信息指数（Shannon information index，I）和观测杂合 度（Observed heterozygosity，HO），NTSYSpc 2.1 软件估算成对无性系间的遗传相似系数（GS，Genetic similarity），选取非加权类平均法（Unweighted pair group method arithmetic averages,UPGMA）选项，进行遗传聚类分析。

1.2.5 指纹数据库的构建

每份无性系材料的指纹图谱身份证由1 组数字组成。每对引物扩增出的条带，按条带分子量大小，对相应的条带进行编号（分子量越大，数字越小。如分子量最大，编为01；次之，编为02，以此类推）。纯合体为1 条带，由相同数字组成；杂合体为2 条带，由对应条带的2 个不同数字组成。

2 结果与分析

2.1 SSR 引物的多态性分析

利用筛选出的14 对引物（表1），采用TPM13-SSR 技术对141 份杨树无性系种质的基因组DNA 进行PCR 扩增检测，共检测到多态性条带91条，多态位点百分比为92.86%。每个位点上的等位基因数目变异幅度为2～12，平均每个SSR 位点上的等位基因数目为6.5。其中，GCPM1599 位点上的等位基因数最多（12），ORPM158、ORPM180 和ORPM214 位点上的等位基因数目最少（2）。

表1 SSR 引物信息†Table 1 Information of SSR primers

14 对SSR 引物分型的结果表明，南林70 和南林S366 无性系的基因型相同。引物ORPM317在湘林系列无性系中只检测到1 个条带，在其他供试无性系种质材料中仅检测到2 个条带。采用Cervus 3.0.7 估算各位SSR 位点无效等位基因频率的结果表明，引物ORPM317 无效等位基因频率大于0.2，该引物位点可视为无效等位基因位点[22]。去除引物ORPM317，13 对引物位点上的等位基因数目变动幅度为2～12，平均值为6.8；Shannon’s信息指数变化范围为0.13～1.91，平均值为0.97；多态信息含量为0.19～0.81，平均值为0.56，观测杂合度为0.06～0.76，平均值为0.40。图1为ABI3730XL 毛细管电泳系统检测引物ORPM409在8 份杨树无性系中的扩增图谱。这表明本研究筛选的13 对引物位点多态性较高。

2.2 指纹数据库构建

构建种质DNA 指纹数据库，常用的方法是分子标记引物组合法。在满足能分辨种质基因型的前提下，尽可能选择数量较少的分子标记引物构建指纹图谱[21]。为此，本研究首先进行成对SSR引物组合，评价成对引物的组合对供试杨树无性系种质材料的分辨率。再以成对SSR 引物分辨率最高的组合为基础，逐步增加引物组合的数量，直到能将所有供试的杨树无性系种质材料全部区分开来。

选取高于所有引物Shannon’s 信息指数平均值的7 对引物ORPM214、ORPM330、ORPM409、GCPM1295、GCPM1599、GCPM1663 和PMGC2765 进行成对组合，发现引物GCPM1599和GCPM1295 组合，分辨率最高，能够鉴别53份杨树无性系种质材料，分辨率为37.85%；在此组合基础上，增加引物组合数量到3 个，发现GCPM1599、GCPM1295 和PMGC2765 组合在3 个引物组合中分辨率最高，能够鉴别113 份杨树无性系种质材料，分辨率为80.71%；引物组合数量增加至4 个（GCPM1599、GCPM1295、PMGC2765 和ORPM330），可鉴别133 份杨树无性系种质材料，分辨率为95.00%；5 对引物GCPM1599、GCPM1295、PMGC2765、ORPM330 和ORPM409 组合，能鉴别137 份 杨树无性系种质材料，分辨率为达97.85%；6 对引物GCPM1599、GCPM1295、PMGC2765、ORPM330、ORPM409 和ORPM214 组合，可鉴别140 份杨树无性系（NL70 与NLS366 为同一基因型），分辨率为100%。6 对引物构建属于每份杨树无性系种质材料的唯一的指纹图谱代码（表2）。

图1 引物ORPM409 在8 份杨树无性系中的扩增图谱Fig.1 Polymorphic finger prints detected by ORPM-409 for 8 Populus clones

表2 141 份杨树无性系种质的指纹图谱Table 2 Fingerprint map of partal materials of 141 Populus clones

表2 141 份杨树无性系种质的指纹图谱Table 2 Fingerprint map of partal materials of 141 Populus clones

2.3 聚类分析

将13 对SSR 引物对每份杨树无性系种质材料扩增的条带转换成0，1 矩阵，采用NTSYS-pc 2.1软件，基于UPGMA 法进行遗传聚类分析，其结果见图2。

由图2可知，参试的141 份杨树无性系种质材料可划分为3 大类群。

类群I 为南林（NL）系列无性系材料。南林系列杨树无性系是从美洲黑杨I-69 和欧美杨I-45杂交子代中选育出来的，亲缘关系很近。遗传聚类结果符合杨树无性系种质的谱系关系。

类群II包括中林108（ZL108）、中潜1号（ZQ1）、中潜3-2（ZQ3-2）、浙7（Z7）、中驻2 号（ZZ2）、中驻4 号、中柱6 号（ZZ6）、中柱7 号（ZZ7）、中驻8 号（ZZ8）、中柱9 号（ZZ9）、中皖1 号（ZW1）、中皖2 号（ZW2）、丹红杨（DHY）、A65/27、南抗3（NK3）、南抗4（NK4）、I69。中潜系列、中驻系列、中皖系列都是从I69 杨为母本，I63 杨为父本的杂交组合中选育出来的优良无性系，本研究的遗传聚类结果与其谱系关系完全一致；类群II 中，丹红杨的亲本为50 号杨与36号杨，推测其亲本可能与I69 杨、I63 杨亲缘关系较近。A65/27 父本是智利黑杨，母本为南方型美洲黑杨，与类群II 中其它杨树无性系聚在一起，这与其种质的谱系关系不一致。这可能是湖南省泰格林纸集团有限责任公司在杨树国家种质资源库无性系材料收集、保存过程中，编号错误造成的种质混淆。

类群III 为湘林（XL）系列无性系材料。湘林系列无性系是从美国引进的优良杨树无性系为亲本，通过人工有性杂交与无性系选育出来的。52 份无性系种质材料中，19 份无性系（XL305～XL427）是从湘林59 半同胞家系中选择出来的无性系，13 份（XL71～XL106）是从湘林86 半同胞家系中选择出的无性系。遗传聚类的结果与其谱系关系基本一致。

图2 141 份杨树无性系种质遗传聚类图像Fig.2 The clustering map of 141 Populus clones

3 结论与讨论

湖南省泰格林纸集团有限责任公司国家杨树种质资源库中收集、保存的杨树无性系种质中，有相当一部分无性系种质材料的谱系关系不清，因此，开展杨树无性系种质鉴定工作迫在眉睫。由于国家杨树种质资源库中，部分无性系材料是从同一的半同胞家系或全同胞家系中选育出的，种质材料之间形态学特征差异很小，难以从表型方面进行区分。分子标记技术不受环境条件影响，是快速鉴别杨树种质的重要技术手段[4]。TP-M13-SSR 技术能够精准判读、识别PCR 扩增产物的大小，已成为植物种质资源的指纹图谱构建的首选分子标记[16,19-23]，但是，SSR 分子标记中无效等位基因的存在，是其自身不可避免的缺陷，会使研究结果产生偏差[24-25]。为了保证研究结果能在林业生产实践中准确、快速地鉴定杨树优良无性系，本研究中剔除掉无效等位基因频率大于0.2 的SSR引物。随着第三代DNA 高通量测序技术发展和测序成本降低，采用SNP 标记技术有望应用于杨树无性系种质鉴别和指纹图谱构建工作中[26]。

本研究基于TP-M13-SSR 技术的分子数据，进行UPGMA 聚类分析的结果与参试的杨树无性系种质记录的谱系关系基本相符合，这与前人研究结果一致[4,16,19-21]。本研究中，个别无性系种质与其谱系关系不一致，可能是种质收集、保存过程中编号错误引起。所有引物都没有检测到NL70和NLS366 无性系之间的条带差异，基因分型的结果为同一基因型，很有可能NL70 和NLS366 是相同无性系，种植编号时产生的错误。南林系列与湘林系列无性系种质间遗传相似系数最小，有望通过南林系列与湘林系列无性系种质间杂交制种，从中选育出符合林业生产上需要的优良无性系品种。

贾会霞等[4]利用ORPM409、GCPM1599 引物分别检测到6 个等位基因，但这2 对引物在本研究中检测到分别为8 和12 等位基因，这可能是参试无性系种质材料不同引起的。贾会霞等[4]采用3 对引物，能够完全辨别所有参试材料的遗传身份，但本研究需要6 对引物，推测其原因，可能是本研究中部分参试的无性系种质材料是从同一家系中选育出来的，遗传关系较近。

本研究基于TP-M13-SSR 技术构建了湖南省岳阳杨树国家种质资源库收集的无性系指纹数据库，研究结果为深入了解杨树国家种质资源库收集保存杨树无性系种质材料的遗传背景提供了参考依据，有利于提高杨树无性系资源的利用效率，对杨树优良无性系品种的鉴定、保护，林业生产上假冒伪劣无性系的识别，以及杨树特异种质创制和新品种选育等方面具有重要的理论指导意义和实际应用价值。