DCD供肾灌注液生物标志物预测肾移植术后移植物功能延迟恢复的临床应用研究

李馨 孙泽家 蔡继飞 王玮

我国于2015年1月1日起开始停用传统的尸体供肾，主要采用心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death，DCD）供肾。肾移植术后移植物功能延迟恢复（delayed graft function，DGF）是术后早期严重的并发症，国外研究发现DGF发生率高达25.2%～58.5%[1-3]，而采用DCD供肾是其发生的重要危险因素[4]。DGF还可增加急性排斥反应、早期移植物失功、慢性排斥反应等并发症的发生风险。有研究表明，发生DGF肾移植受者的术后1年内移植物失功的发生率成倍增长[5-8]。因此，早期评估供肾功能，及时诊断和治疗DGF有助于挽救移植物功能，延长受者和移植肾存活时间。

近年来，一些可用于预测肾移植术后DGF发生的生物标志物受到了器官移植界的广泛关注，如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL）、肝型脂肪酸结合蛋白（liver-type fatty acid-binding protein,L-FABP）、白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）、肾损伤分子-1（kidney injury molecule，KIM-1）等。随着器官保存方式的改进，生物标志物的取材也从供、受者体液标本逐渐转向更加无创的灌注液标本[1,9-15]。除了机械灌注仪器中的灌注液标本，近期也有研究证明，静态冷保存（static cold storage, SCS）的供肾在行静态冲洗灌注时，灌注液中亦可检测出与DGF发生相关的生物标志物[2]。这为我国一些尚未常规使用机械灌注仪器的移植中心提供了新的研究方向。本研究通过检测DCD供肾SCS灌注液中所含的4种生物标志物NGAL、KIM-1、L-FABP和IL-18的水平，探讨其预测肾移植受者术后DGF发生的可行性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2016年8月7日至2017年12月13日在首都医科大学附属北京朝阳医院首次接受DCD供肾肾移植的64例受者和47例供者的临床资料。纳入标准：（1）供肾热缺血时间＜10 min；（2）供者无心肺复苏史；（3）获取前供者收缩压＞ 100 mmHg（10 mmHg=1.33 kPa）。47例供者中，男40例，女7例，年龄48（36，66）岁。死亡原因分别为脑出血20例、脑外伤26例、外伤1例。47例供者共获取94个供肾，本研究共纳入供肾64个，其余供肾均分派给其他器官移植中心使用。

根据受者术后是否发生DGF分为DGF组（7例）与即刻肾功能恢复（immediate graft function，IGF）组（57例）。DGF诊断标准为：同种异体肾移植术后1周内需进行血液透析或血液滤过肾脏替代治疗。DGF组中，男6例，女1例，年龄（45±8）岁，原发病包括IgA肾病4例，慢性肾小球肾炎1例，血管胶质瘤综合征1例，其他1例；IGF组中，男37例，女20例，年龄（43±12）岁，原发病包括IgA肾病32例、慢性肾小球肾炎13例、紫癜性肾炎1例，多囊肾1例，其他10例。两组受者年龄、性别等基线资料比较，差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。本研究经首都医科大学附属北京朝阳医院伦理委员会审核通过，所有患者或家属均签署知情同意书。

1.2 手术方式及术后免疫抑制方案

受者均于全身麻醉下行同种异体肾移植术。术前使用巴利昔单抗或抗人T细胞免疫球蛋白进行免疫诱导，术后常规采用他克莫司+吗替麦考酚酯+泼尼松的三联免疫抑制方案。

1.3 检测方法

严格控制修肾液体入量，取各组DCD供肾术前SCS灌注液20 mL进行检测，分别采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）检测并计算其中NGAL、KIM-1、IL-18和L-FABP 4种生物标志物的水平。

1.4 研究方法

比较两组供肾灌注液各生物标志物（NGAL、KIM-1、IL-18和L-FABP）的水平并分析其与DGF的相关性；分析各生物标志物对肾移植受者术后发生DGF的预测价值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用t检验；不符合正态分布的计量资料以中位数（下四分位数，上四分位数）表示。组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料以率表示。相关性分析采用Spearman法。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析各生物标志物预测DGF的灵敏度和特异度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组供肾灌注液各生物标志物水平的比较及与DGF的相关性分析

64例DCD供肾肾移植受者中，7例术后发生DGF，发生率为11%（7/64）。对两组受者的DCD供肾灌注液中4种生物标志物水平进行检测发现，NGAL、L- FABP、 KIM-1、IL-18的样品检出率分别为100%、97%、98%、61%。DGF组的NGAL水平高于IGF组（P=0.009），两组间IL-18、KIM-1和L-FABP水平差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。两组DCD供肾灌注液中各生物标志物的水平见图1。

图1 两组DCD供肾灌注液中各生物标志物水平的比较Figure 1 Comparison of biomarker levels in DCD donor kidney perfusate between two groups

Spearman相关性分析结果显示，灌注液中的NGAL水平与肾移植术后DGF的发生呈正相关（r=0.430，P＜0.001）。

2.2 各生物标志物对肾移植受者术后发生DGF的预测价值分析

ROC曲线结果显示，DCD供肾灌注液中NGAL和KIM-1水平升高对肾移植受者术后发生DGF具有一定的预测价值，最佳截取值分别为204.130 ng/mL和100.480 ng/mL，诊断DGF的灵敏度分别为1.000和1.000，特异度分别为0.719和0.702，预测DGF发生的曲线下面积（area under curve，AUC）可达最高，分别为0.897[95%可信区间（confidence interval，CI） 0.798～0.997]和 0.782（95%CI0.676～0.888）（均为P＜0.05，图2）。而L-FABP和IL-18则无明显预测意义（均为P＞0.05，图2）。

图2 各生物标志物预测肾移植受者术后发生DGF的ROC曲线分析Figure 2 ROC curve analysis of each biomarker for predicting DGF in recipients after renal transplantation

当联合检测NGAL和KIM-1时，预测肾移植受者术后发生DGF的AUC为0.932（95%CI0.850～1.000），灵敏度为1.000，特异度为0.754（P＜0.05），表明联合检测NGAL和KIM-1具有较好的预测效能。

3 讨 论

近年来随着免疫学及移植学领域的不断发展，肾移植受者的生存时间大幅度延长，但DCD供者与扩大标准供者（expended criteria donor，ECD）的使用增加，导致肾移植术后DGF、移植肾原发性无功能等并发症的发生率越来越高。文献报道我国DCD供肾肾移植术后DGF的发生率为15.2%～31.0%[7]，而在国外部分移植中心肾移植术后DGF的发生率可高达25.5%～85.0%[1-3,16-18]。DGF可增加术后早期移植物失功、移植物功能障碍和慢性移植肾排斥反应相关风险[4-5,19-20]，因此减少使用高风险供肾，早期诊断和干预应作为DGF综合治疗的重中之重。

目前国际上DGF的临床诊断标准尚存在主观性较强或诊断时间延迟从而影响治疗等问题[21]。近年来研究者从供、受者的生物样本中提取生物标志物进行检测，在肾移植术后发生DGF的预判方面已经取得了不错的进展。有研究报道，从供者的血液、尿液中提取NGAL、胱抑素C等进行检测，可以发现其与肾移植受者术后DGF发生存在相关性[18,22-23]；在受者的尿液和血液中检测IL-18、NAGL、L-FABP、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）等亦发现其与肾移植术后发生DGF存在相关性[15,24-30]。研究发现，在供肾灌注液（包括机械灌注液及SCS灌注液）中检测相关生物标志物也可发现其与DGF的发生、持续时间以及受者长期预后存在相关性。检测灌注液中的生物标志物对受者影响小且易于获得，能在手术之前对供肾质量进行提前预判，进而给出指导性的免疫治疗方案，因而受到了研究者的广泛关注[31]。

目前国际文献报道的可以用来预测DGF的生物标志物大多是在机械灌注液中得到的[1,3,17,32]。笔者在进行本研究前进行相关文献检索时，仅发现1篇文章使用了同样的SCS状态下的供肾静态灌注冲洗液作为生物检材检测部分相关生物标志物，证实灌注液中的NGAL水平升高是DGF发生的危险因素[2]。经笔者查阅文献，本研究为国内外首次报道DCD供肾术前SCS灌注液中的NGAL、L-FABP、KIM-1、IL-18均可被检测出，除了IL-18以外，NGAL、L-FABP、KIM-1在灌注液中的检出率均在95%以上。Hoogland等[17]对低温机械灌注4 h后的机械灌注液进行研究发现，灌注液中的NAGL水平与DGF的发生存在相关性。与以往研究结果一致，本研究证实了灌注液中的NGAL水平与DGF的发生呈正相关（r=0.430，P＜0.001）。同时发现，NGAL和KIM-1都可以在一定程度上预测肾移植术后DGF的发生，其中NGAL对DGF的预测准确性更加可靠。联合检测NGAL与KIM-1评估供肾功能时，其预测准确性更佳。

SCS灌注液与机械灌注液相比，其优势包括成本低廉、获取样本浓度更高等。对于我国很多尚未广泛使用机械灌注作为供器官保存方式的移植中心而言，仅通过供肾术前SCS灌注液就可以获得同样具有临床评价意义的生物标本，可使移植中心和受者从中同时获益。

本研究亦存在一些不足之处，如无法排除术中血压变化等因素的干扰，未能将供者更加详细的信息纳入对比等。本次入组样本量较少，需要在将来的临床及科研工作中扩大样本量，从而获得更有临床指导意义的研究结果，以更准确、科学地评估供肾生物标志物与肾移植术后DGF发生风险的关系。

综上所述，本研究首次证明了可将供肾术前SCS灌注液作为研究样本检测NGAL、L-FABP、KIM-1、IL-18水平，且发现NGAL水平与肾移植术后DGF的发生存在相关性。单独检测NGAL或KIM-1可在一定程度上预测肾移植受者术后DGF的发生。联合检测灌注液中的NGAL和KIM-1可以较好地预测肾移植受者术后DGF的发生。后续研究可以此为基础扩展样本量，继续深入相关方向的研究，从而获得更具有临床指导意义的研究结果。