右美托咪定抑制脾切除术后老年大鼠蓝斑nNOS、c-Fos和relaxin-3表达的增加

熊波，吴锋

（1复旦大学附属肿瘤医院麻醉科，上海 200032；2皖南医学院解剖学教研室，芜湖 241002）

外科手术创伤作为一种高强度的应激源，可引起机体多系统生理功能的改变，以致影响手术的安全性，也可影响术后患者的转归。因此，寻找合适的方法减轻外科手术创伤应激反应和降低术后并发症的发生率，对患者术后恢复是很必要的。右美托咪定（dexmedetomidine, Dex）是一种新型的α2肾上腺素能受体激动剂，能抑制交感神经兴奋，产生有效镇痛、镇静作用，广泛应用于临床麻醉辅助用药，并具有一定的缓解应激的作用[1]。有研究表明，多种伤害性刺激都可诱导神经源性一氧化氮合酶（nNOS）、c‐Fos和松驰素‐3（relaxin‐3）在神经元内表达[2‐4]。蓝斑是Dex作用的主要部位，Dex能下调内毒素休克大鼠蓝斑过度表达的nNOS和c‐Fos，也能下调脾切除手术大鼠海马CA1区c‐Fos和relaxin‐3表达[5,6]。目前尚未见Dex对脾切除手术大鼠蓝斑nNOS、c‐Fos和 relaxin‐3表达影响的报道，本实验对此进行研究，以探讨外科腹部大手术创伤对老年大鼠的应激机制和Dex对其的干预作用。

材料和方法

1 实验动物与分组

清洁级18月龄雄性Sprague‐Dawley（SD）老年大鼠72只，体重500～600 g [成都简阳达硕动物科技有限公司，许可证号：SCXK（川）2013‐74]，大鼠分笼饲养，每笼1只，自然光照，室温23±2 ℃，相对湿度60%～65%，自由进食（颗粒饲料购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场）和饮水。72只大鼠随机分为生理盐水对照组（C组）、脾切除模型组（S组）、Dex低剂量+脾切除组（LD组，Dex 3 μg/kg）和Dex高剂量+脾切除组（HD组，Dex 12 μg/kg），C组和S组均注射生理盐水2ml/kg，每组再分为1、3和7 d 3个亚组，每亚组6只。除C组外，其余各组大鼠同文献[6]方法实施脾切除术。

2 主要试剂与药品

Dex注射液（130621，江苏恒瑞医药股份有限公司）；戊巴比妥钠（WS20050411，国药集团化学试剂有限公司）；兔抗relaxin‐3（1:150）（bs‐11412R，北京博奥森生物技术有限公司）；兔抗nNOS、c‐Fos（1:150）、β‐actin（1:600，碧云天生物技术研究所）、生物素化兔抗山羊IgG（1:200，二抗）、生物素化羊抗兔IgG（1:100，二抗）、链酶亲和素‐生物素‐过氧化物酶复合液（SABC）、二氨基联苯胺（DAB）显色液、封闭液均购自武汉博士德生物工程有限公司）。

3 免疫组织化学染色

1%戊巴比妥钠（30 mg/kg，i.p）麻醉，断头取脑，用冰生理盐水冲洗，矢状面将脑组织分为左右两半，左半脑置入4%多聚甲醛固定过夜，常规脱水、透明，石蜡包埋，取蓝斑部位连续冠状切片，片厚5 μm。切片分成3套，分别用于nNOS、c‐Fos和relaxin‐3染色。切片常规脱蜡至脱水，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，枸橼酸缓冲液（0.01 mol/L，pH 6.0）微波抗原修复，兔血清封闭液封闭1 h，分别滴加抗nNOS、c‐Fos和relaxin‐3一抗，4℃冰箱过夜孵育，分别滴加1:200生物素化羊抗兔IgG（nNOS和c‐Fos）和生物素化兔抗山羊IgG (relaxin‐3)，室温孵育2 h，SABC（1:100）室温孵育1 h，DAB显色。以上各步后均用pH7.4的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）充分清洗（5 min×3次）。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。为了保证可比性，实验过程中各组所用酶反应液、反应时间及温度等均相同。本实验中，用PBS代替一抗作为阴性对照，阴性对照组无表达。nNOS、c‐Fos和relaxin‐3免疫反应产物均呈棕黄色或棕褐色，着色部位主要在胞体和突起的胞浆内，细胞核不着色成空泡状或非常淡染。每只大鼠蓝斑各取3张相同部位切片，每张切片取3个细胞，每组合计54个细胞，Olympus BX51显微镜（Olympus公司，日本）观察并拍片，Image J 图像分析软件测定nNOS、c‐Fos和relaxin‐3阳性反应产物灰度值，取其平均值进行半定量分析。

4 Western blot

取右半脑的蓝斑组织以RIPA裂解液提取组织总蛋白后，根据目的蛋白的分子量大小配置SDS‐PAGE凝胶，上样后进行电泳，以湿转方式将蛋白转移至PVDF膜上，转膜后用5%脱脂奶粉封闭，室温摇床摇晃2 h；加入抗nNOS和c‐Fos 抗体（稀释度1:200）孵育，4 ℃过夜（18 h），TBST缓冲液（TBS缓冲液100 ml，加1 ml吐温20，用蒸馏水定容至1L）洗脱3次，每次10min；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（稀释度1:1000），室温孵育2 h，TBST缓冲液漂洗3次，每次10 min。ECL化学发光显色、X光胶片曝光、显影、定影，胶片经扫描后，将所得图像在凝胶成像分析系统中测定各组大鼠蓝斑中nNOS和c‐Fos及内参（β‐actin）条带的平均吸光度值，以目的蛋白与内参蛋白的比值作为目的蛋白的相对表达量。

5 统计分析

采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Dex抑制脾切除老年大鼠蓝斑神经元中nNOS、c-Fos和relaxin-3免疫反应性增强

免疫组织化学染色检测显示：脾切除大鼠术后1 d和3 d蓝斑神经元中nNOS、c‐Fos和relaxin‐3免疫反应性明显增强，表现为免疫反应阳性产物明显增加，着色明显增强；术后7 d蓝斑神经元中nNOS、c‐Fos和relaxin‐3免疫反应性与对照组比较无明显变化。与脾切除模型组比较，LD和HD Dex组大鼠术后1 d和3 d蓝斑神经元中nNOS、c‐Fos和relaxin‐3免疫反应性明显减弱，其中HD组减弱更为明显；而术后7 d蓝斑神经元中nNOS、c‐Fos和relaxin‐3免疫反应性各组之间无明显差异（图1—3）。

图1 Dex对脾切除老年大鼠蓝斑神经元中nNOS表达影响的免疫组织化学检测。A，蓝斑中nNOS免疫组织化学染色的代表性图像；比例尺，50 μm。B，蓝斑中nNOS免疫反应性统计学分析；与C组比较，*P ＜ 0.05；与S组比较，#P ＜ 0.05；与 LD组相比，△P＜ 0.05；n=6Fig.1 Immunohistochemical examination for the effect of Dex on nNOS expression in the locus coeruleus neurons of aged rats after splenectomy. A,representative images of nNOS immunohistochemical staining in the locus ceruleus; scale bar, 50 μm; B, statistical analysis of nNOS immunoreactivity in the locus coeruleus; *P ＜ 0.05 vs C group; #P ＜ 0.05 vs S group; △P ＜ 0.05 vs LD group; n=6

2 Dex下调脾切除老年大鼠蓝斑nNOS和c-Fos蛋白表达水平

Western blot实验结果显示：与C组相比，老年大鼠术后1 d和3 d的S组蓝斑nNOS和c‐Fos蛋白表达水平均明显增加，术后7 d蛋白表达水平无显著差异；与S组相比，术后1 d和3 d的LD、HD组nNOS和c‐Fos蛋白表达均明显降低，而术后7 d蛋白表达水平则无明显差异（图4）。由此提示Dex对老年大鼠术后蓝斑神经元具有下调nNOS和c‐Fos的作用。

图4 Dex对脾切除老年大鼠蓝斑神经元中nNOS和c‐Fos水平影响的Western blot检测。A，蓝斑中nNOS和c‐Fos水平代表性Western blot检测结果。B，蓝斑中nNOS和c‐Fos水平的统计学分析；与C组比较，*P ＜ 0.05；与S组比较，#P＜ 0.05；与 LD组相比，△P＜ 0.05；n=6Fig.1 Western blot detection for the effect of Dex on the levels of nNOS and c‐Fos in the locus coeruleus neurons of aged rats after splenectomy. A,representative results of the levels of nNOS and c‐Fos detected by Western blot in the locus ceruleus; B, statistical analysis of the levels of nNOS and c‐Fos in the locus coeruleus; *P ＜ 0.05 vs C group; #P＜ 0.05 vs S group; △P＜ 0.05 vs LD group; n=6

图2 Dex对脾切除老年大鼠蓝斑神经元中c‐Fos表达影响的免疫组织化学检测。A，蓝斑中c‐Fos免疫组织化学染色的代表性图像；比例尺，50 μm。B，蓝斑中c‐Fos免疫反应性统计学分析；与C组比较，*P ＜ 0.05；与S组比较，#P＜ 0.05；n=6Fig. 2 Immunohistochemical examination for the effect of Dex on c‐Fos expression in the locus coeruleus neurons of aged rats after splenectomy. A,representative images of c‐Fos immunohistochemical staining in the locus ceruleus; scale bar, 50μm; B, statistical analysis of c‐Fos immunoreactivity in the locus coeruleus; *P＜ 0.05 vs C group; #P ＜ 0.05 vs S group; n=6

讨 论

我们的社会正在步入老龄化，由于医学技术的发展，更多的老年患者需要接受手术治疗，但老年人生理条件较特殊，一些手术，尤其是腹部大手术，对老年病人的损伤更大，更易出现较重的术后应激[7]。手术作为一种特殊类型的创伤是外科病人中最常见的应激源生物因素，其中手术创伤程度决定了机体围手术期应激反应的强弱[8]。手术创伤越大，应激反应越强。本研究是对老年大鼠腹部大手术脾切除进行术后应激可能的机制研究，具有一定的临床意义。

Dex是一种新型的α2肾上腺素能受体激动剂，能抑制交感神经兴奋，缓解应激，具有一定的脑保护作用，是广泛应用于临床麻醉的辅助用药[9,10]。Dex的镇静镇痛而不影响呼吸的药理特点，使其在老年患者麻醉中显示出独特的优势作用，可降低术中应激反应和抑制插管引起的应激反应，已经越来越多地被应用于老年患者麻醉管理[11,12]。

图3 Dex对脾切除老年大鼠蓝斑神经元中relaxin‐3表达影响的免疫组织化学检测。A，蓝斑中relaxin‐3免疫组织化学染色的代表性图像；比例尺，50 μm。B，蓝斑中relaxin‐3免疫反应性统计学分析；与C组比较，*P ＜ 0.05；与S组比较，#P ＜ 0.05； n=6Fig. 3 Immunohistochemical examination for the effect of Dex on nNOS expression in the locus coeruleus neurons of aged rats after splenectomy. A,representative images of nNOS immunohistochemical staining in the locus ceruleus; scale bar, 50 μm; B, statistical analysis of relaxin‐3 immunoreac‐tivity) in the locus coeruleus; *P ＜ 0.05 vs C group; #P＜ 0.05 vs S group; n=6

蓝斑是应激时情绪变化及行为改变的结构基础，是应激反应的关键部位[13‐15]，也是脑干含nNOS阳性神经元的主要部位之一[16]。nNOS催化生成的NO具有抑制和介导氧化损伤的双重作用，正常范围内可清除机体内多余氧自由基，减轻机体氧化应激反应，一旦水平升高，则会加重机体氧化应激损伤，导致脑损伤和神经元大量死亡[17]。有研究表明，机体受到手术这种刺激，诱导NOS表达，NOS的激活又可诱导c‐Fos等转录因子的表达[18]，急性攻击应激会引起大鼠蓝斑c‐Fos表达增加[19]。c‐Fos在促进蓝斑激活，使其释放去甲肾上腺素（NE）方面都起着重要的作用。从基因和蛋白质的角度研究也表明：抑郁、电击、免疫损伤、社会压力等不同种类的应激都会激活蓝斑NE能系统，引起蓝斑c‐Fos mRNA和蛋白质表达的改变[20,21]。

Dex可降低nNOS和c‐Fos阳性神经元表达，有实验研究表明，大鼠在坐骨神经结扎后热痛阈降低，脊髓中央管周围灰质nNOS阳性神经元显著升高。注射Dex可使nNOS阳性神经元表达显著降低[22]。我们以前的研究也观察到Dex对内毒素性休克大鼠蓝斑c‐Fos及蓝斑和海马结构nNOS过高表达有明显的下调作用[5,23]。也有作者发现在脑缺血模型中，Dex可以抑制创伤性刺激后海马CA1区、CA3区和DG区c‐Fos的表达，对神经元有保护作用[24]。

本研究观察到脾切除术后1 d和3 d时，蓝斑nNOS和c‐Fos蛋白表达显著增强，但术后7 d的表达与对照组相比，则无明显差异。这与我们曾报道老年大鼠脾切除术后1 d和3 d，海马CA1区c‐Fos表达均显著强于对照组的结果相似[6]。这可能是老年大手术患者容易出现较重的术后应激反应的机制之一。通过使用不同剂量Dex的术前干预，可明显降低老年大鼠脾切除术后蓝斑nNOS和c‐Fos阳性神经元表达，其原因可能是Dex对脑组织有一定的保护作用，改善脑氧代谢，由此减轻氧化应激反应[25]。

Relaxin‐3是一种兴奋性神经递质，主要参与应激反应、摄食行为、唤醒和认知[26,27]。在创伤和应激状态下，relaxin‐3会大量过度表达，可能会产生神经毒性而引起神经元凋亡和脑损害[28]。对脾切除手术的老年大鼠POCD（Postoperative cognitive dysfunc‐tion, POCD）的研究发现，术后1 d和3 d时，海马CA1区relaxin‐3神经元表达明显增加，认为relaxin‐3的过度表达可能与手术刺激的应激引起神经元过度兴奋、诱发兴奋毒性有关，其神经毒性可使凋亡蛋白表达增加，抗凋亡蛋白表达减少，促进海马结构神经元凋亡，这可能是老年大鼠产生POCD的机制之一。同时我们也观察到Dex可能通过抑制老年大鼠术后海马结构的过度激活，减少relaxin‐3表达，而降低POCD的发生[6]。本研究采用免疫组织化学方法观察到，脾切除术后1 d和3 d蓝斑的relaxin‐3表达均较对照组显著增强。这也可能是脾切除术后应激的机制之一。Dex降低老年大鼠脾切除术后蓝斑relaxin‐3表达的确切机制则尚需进一步研究。

综上所述，老年大鼠脾切除术后蓝斑nNOS、c‐Fos和relaxin‐3的表达显著增加，Dex可显著降低蓝斑nNOS、c‐Fos和relaxin‐3的表达。这可能是Dex降低手术创伤应激的重要机制之一。