异氟烷减轻肝细胞缺氧/复氧损伤

王彦利，师爱青，张咸虎

（焦作煤业集团有限责任公司中央医院麻醉科，焦作 454000）

肝缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤是一种常见的临床并发症，经常发生在肝移植、肝切除、休克和创伤后，其可导致器官功能受损甚至衰竭[1]。因此，临床上急需解决这一问题。

肝缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤包括细胞缺氧损伤和再氧合诱导的细胞毒性反应的两个过程[2]。细胞处于无氧代谢时，可导致各种肝细胞功能障碍[3]。肝组织缺氧后再氧合后产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），这进一步加重肝细胞损伤[4]。实验证据表明，肝细胞损伤通常伴有肝细胞坏死和细胞凋亡，这是肝I/R损伤期间肝细胞死亡的主要原因[5,6]。TRLs是先天免疫反应中最具代表性的受体之一，Toll样受体‐4（toll‐like receptor 4，TLR4）能够识别并结合病原微生物或宿主标记细胞死亡表面的特定分子结构，如病原体相关的分子模式和损伤相关的分子模式[7]。TLR4在单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和实质肝细胞中均有表达[8,9]。TLR4信号包括两个经典的级联：髓样分化因子‐88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖途径和非依赖途径，激活后可以导致细胞凋亡[10,11]。TLR4触发的固有免疫反应可引起肝H/R损伤[12]。异氟烷（isoflurane，ISO）是临床中最常应用的全身麻醉药，已有研究[13]报道，异氟烷预处理对肝I/R损伤有保护作用，但具体机制尚不清楚。因此，基于目前关于TLR4、MyD88参与的细胞凋亡和ISO的肝保护作用的知识，本研究旨在一步评估ISO预治疗在肝I/R损伤中的肝保护特性和潜在的作用机制。

材料和方法

1 主要试剂

正常人肝细胞系（HL‐7702，中科院上海细胞库）；10%胎牛血清（FBS）、RPMI‐1640培养基（美国Hyclone公司）；MTT试剂盒（江苏凯基生物科技公司）；LDH检测试剂盒和DAPI试剂（上海碧云天生物技术公司）；细胞内ROS测定试剂盒（美国Sigma‐Aldrich）；TUNEL检测试剂盒（美国Roche公司）；兔抗FADD、TLR4、MyD88及TRAF6抗体（武汉三鹰生物技术)；辣根过氧化物偶联的羊抗兔IgG和ECL化学发光试剂盒（武汉博士德生物技术公司）。

2 细胞培养

将HL‐7702接种于含有10% FBS和抗生素（100U/ mL青霉素和100 μg/ mL链霉素）的RP‐MI‐1640培养基中，放在37℃含5%CO2的培养箱中培养。

3 H/R模型建立

缺氧处理前将培养液换为无血糖/血清培养液，然后在缺氧培养箱（含1%O2、94%N2和5%CO2）培养4 h，然后向培养液添加血糖/血清并放在正常环境（含95%空气和5%CO2）复氧培养4 h。

4 实验分组

将细胞分为对照组（Con）、H/R组和不同浓度处理的ISO组。HR组经4 h缺氧和4 h复氧处理；ISO预处理组分别经不同浓度ISO（0.5%、1%、1.5%）预处理20 min后，进行4 h缺氧和4 h复氧处理。收集细胞进行相关实验。

5 细胞活性测定

通过MTT法检测细胞活性。将肝细胞分别以1×104细胞/孔的密度接种到96孔板中。用不同浓度的ISO预处理后的肝细胞放置于H/R条件下培养。然后在每个孔板中加入0.5%MTT试剂，孵育4 h后，去除上清液，在室温下加入100 μL二甲基亚砜（DMSO）溶解晶体。然后使用酶标仪测定570 nm处吸光度值。

6 LDH活性检测

参照试剂盒说明，使用LDH检测试剂盒检测细胞LDH活性。即经规定条件处理后，分别取各组120 μL细胞上清液，并加入到96孔板中，加入60 μL LDH检测溶液，避光孵育30 min后，测量溶液在490 nm处的吸光度值，根据标准曲线计算LDH水平。

7 ROS水平检测

用ROS荧光探针法测定细胞内ROS水平。收集各组细胞并用完全培养基制作细胞密度为1×106个/ mL悬液，各取500 μL细胞悬液加入到1.5 mL EP管中，并加入10 μL染色剂检测工作液，37℃避光培养30 min，加入10 μL染色保存液。每组取10 μL已染色的细胞悬液加到载玻片上，盖上盖玻片，荧光显微镜（德国徕卡Leica DM6000B）下（λex= 650 nm，λem = 675 nm）定性观察并拍照。每组取400 μL已染色的细胞悬液加到1 mL比色杯中，使用荧光分光光度计（日本Hitachi F‐7000）（λex= 650 nm，λem = 675 nm）定量检测细胞相对荧光单位（荧光强度）。

8 细胞凋亡TUNEL染色法检测

制作细胞涂片，按照TUNEL检测试剂盒说明进行TUNEL染色，细胞核用DAPI染色10 min。用荧光显微镜拍摄TUNEL阳性肝细胞和总肝细胞的数量，并应用Image Pro Plus软件测定细胞凋亡比例。

9 蛋白印迹分析

参照文献的方法进行蛋白质印迹分析[14]。使用以下抗体：FADD（1:1000稀释）、TLR4（1:3000稀释）、MyD88（1:2000稀释）以及TRAF6（1:4000稀释）。随后用TBS‐T洗膜，再与辣根氧化物酶（HRP）的二抗孵育1 h。加入ECL发光液使蛋白条带可视化。使用Image J软件检测条带的光密度值分析印迹。

10 统计学分析

使用SPSS 19.0分析软件进行所有数据统计分析。所有数据表示为均值±标准差。多组间均数比较采用方差分析。P＜0.05表示具有统计学意义。

结 果

1 异氟烷抑制缺氧/复氧所致肝细胞活性降低和LDH活性升高

应用MTT法检测细胞活力及应用LDH试剂盒检测LDH活性显示：与Con组相比，H/R组肝细胞活性显著降低，LDH活性显著升高；与H/R组比较，不同剂量ISO治疗组的肝细胞活性随着ISO浓度升高呈现剂量依赖性增加，LDH活性随着ISO浓度升高呈现剂量依赖性降低（图1）。

图1 异氟烷对缺氧/复氧损伤HL‐7702细胞的细胞活性和LDH活性的影响。A，细胞活性（MTT法检测）统计学分析；B， LDH活性（LDH检测试剂盒法）统计学分析。与Con组比较：###P＜0.001；与H/R组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；n=5Fig.1 Effects of isoflurane on cell viability and LDH activity in HL‐7702 cells injured by hypoxia/reoxygenation; A, statistical analysis of cell viability assayed with MTT method; B, statistical analysis of LDH activity assayed with LDH kit method. ###P＜0.001, compared with Con group; *P＜0.05,**P＜0.01, ***P＜0.001, compared with H/R group; n=5

2 异氟烷降低H/R肝细胞内ROS水平

应用ROS荧光探针检测ROS水平显示：H/R肝细胞组产生的ROS明显高于Con组，ISO可减少H/R诱导的肝细胞ROS的生成，且其作用呈剂量依赖性，其中1.5%ISO效果最佳（图2）。

图2 异氟烷对缺氧/复氧损伤诱导HL‐7702细胞ROS生成的影响。A，ROS荧光探针法测定ROS水平的荧光显微镜图像；比例尺，25μm。B，分光光度计法检测ROS水平的统计学分析。与Con组比较：###P＜0.001；与H/R组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；n=5Fig. 2 Effect of isoflurane on hypoxia/reoxygenation injury‐induced ROS production in HL‐7702 cells. A, fluorescence microscopic images of ROS level measured by ROS fluorescence probe method; scale bar, 25 μm. B, statistical analysis of ROS level detected by spectrophotometry. ###P＜0.001,compared with Con group; *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, compared with H/R group; n=5.

3 异氟烷抑制H/R肝细胞的凋亡

应用TUNEL试剂盒染色显示：H/R组HL‐7702细胞凋亡率明显高于Con组，ISO可对H/R诱导的细胞凋亡产生剂量依赖性抑制作用，其中1.5% ISO组抑制效应最强（图3）。

图3 异氟烷对缺氧/复氧损伤诱导的HL‐7702细胞凋亡的影响。A，TUNEL染色检测细胞凋亡；绿色为TUNEL染色的凋亡细胞，蓝色为DAPI染色的细胞核；比例尺，25μm；B， TUNEL阳性细胞比例统计学分析。与Con组比较：###P＜0.001；与H/R组比较：**P＜0.01，***P＜0.001；n=5Fig. 3 Effects of isoflurane on apoptosis of HL‐7702 cells induced by hypoxia/reoxygenation injury. A, TUNEL staining assay for cell apoptosis, apop‐totic cells stained green and nuclei stained blue by DAPI; scale bar, 25 μm. B, statistical analysis of percentage of TUNEL‐positive cells. ###P＜0.001,compared with Con group; **P＜0.01, ***P＜0.001, compared with H/R group; n=5

4 异氟烷抑制缺氧/复氧损伤肝细胞TLR4、FADD、MyD88、TRAF6水平的上调

Western blot检测显示：H/R组HL‐7702细胞内TLR4、FADD、MyD88、TRAF6水平显著高于Con组，ISO处理可显著抑制H/R所致的TLR4、FADD、MyD88、TRAF6水平升高（图4）。

图4 异氟烷对缺氧/复氧损伤HL‐7702细胞中TRL4、FADD、MyD88、TRAF6水平的影响。A，TRL4、FADD、MyD88、TRAF6水平代表性Western blot检测结果；B，TRL4水平的统计学分析；C，FADD水平的统计学分析；D，MyD88水平的统计学分析；E，TRAF6水平的统计学分析。与Con组比较：###P＜0.001；与H/R组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；n=5Fig. 4 Effects of isoflurane on the levels of TLR4, FADD, MyD88 and TRAF6 in HL‐7702 cells injured by hypoxia/reoxygenation injury. A, representa‐tive Western blot test results of the levels of TLR4, FADD, MyD88 and TRAF6; B, statistical analysis of relative levels of TRL4; C, statistical analysis of relative levels of FADD; D, statistical analysis of relative levels of MyD88; E, statistical analysis of relative levels of TRAF6. ###P＜0.001, compared with Con group; *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, compared with H/R group; n=5

讨 论

肝I/R损伤是构成全球肝移植、肝切除、休克和创伤后治疗失败的主要原因。肝细胞凋亡是肝I/R损伤的典型特征。肝缺血很快就会引起细胞凋亡，再灌注后就会进一步恶化。有证据[15]表明，抑制细胞凋亡过程可减少I/R引起的肝损伤，并降低肝衰竭的风险。因此，抑制凋亡是减轻肝I/R损伤有效的干预措施。

在本研究中，我们评估了ISO在肝细胞I/R模型中的潜在作用，结果表明，ISO处理可以增加H/R细胞的存活率，并降低血清LDH水平和细胞凋亡。目前，普遍认为再灌注期的损伤程度比缺血期更严重，因为在再灌注过程中中产生了大量的ROS。这些ROS可直接损害肝组织，并导致细胞凋亡、血管扩张甚至造成器官衰竭[4]。此外，ROS还会触发机体中炎性介质的释放，进一步损伤细胞[16]。本研究显示，ISO可以减少ROS的生成，减轻肝细胞损引起细胞氧化应激，表明ISO预防肝损伤的至少有部分原因是其抗氧化性。

为了评估ISO对H/R导致的肝细胞损伤的机制，我们进一步分析了死亡受体通路相关蛋白的表达。死亡受体通路是三大细胞凋亡信号转导通路之一，死亡受体在器官中普遍表达，肝细胞及胆管细胞对死亡受体介导的细胞凋亡尤其敏感。TLR4作为在体内普遍表达的死亡受体需要与FADD结合引发细胞凋亡[17]。FADD是死亡受体通路上一种死亡域蛋白，细胞接收到凋亡信号后，配体与死亡受体结合后吸引FADD，在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，从而激活caspase 8，进而引起随后的级联反应，细胞发生凋亡。TLR4广泛存在于肝脏的许多类型的细胞中，并被证明与肝脏H/R损伤的进展有关[18]。TLR4信号包括两个经典的级联：MyD88依赖途径和非依赖途径，激活后可以导致细胞凋亡[10,11]。TRAF6是肿瘤坏死因子（TNF）超家族和Toll样/白细胞介素‐1受体（Toll‐/IL‐1receptor，TIR）超家族的重要接头分子，LTR4被激活后，TRAF6同时介导MyD88依赖性与非依赖信号通路[19]。本研究表明，ISO能抑制H/R诱导的肝细胞中TLR4、MyD88、FADD和TRAF6表达水平增加。本研究提供了一个关于TLR4/MyD88信号通路和ISO抑制I/R损伤肝细胞导致的凋亡之间的新的联系。

总之，ISO能抑制肝H/R造成的肝细胞损伤，其机制包括减轻细胞氧化应激以及下调TLR4、MyD88、FADD和TRAF6来减少细胞死亡来保护肝细胞免受H/R诱导的细胞损伤。因此，在肝外伤手术的麻醉中应用ISO可能是预防肝H/R损伤的重要策略。