基于重组外膜蛋白研制检测副鸡禽杆菌抗体金标试纸

梅 晨 ， 胡 伟 ， 张 雪 ， 王宏俊

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所 畜禽疫病防控技术北京市重点实验室 ， 北京 海淀 100097)

副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)可以引起鸡发生传染性鼻炎(Infectious coryza,IC)，该病可使蛋鸡产蛋量下降10%～40%，导致育成鸡正常生长发育受到阻滞并引发淘汰率增加[1]。肉鸡发生该病引起肉品质下降，胴体淘汰率增加[2-3]。如今集约化养殖发展快速，该病的发生和流行逐年上升，给养禽业带来了较严重的损失。目前，国内外常用全菌灭活疫苗预防该病，但如何快速准确地检测副鸡禽杆菌抗体、监测疫苗的免疫效果，是实际工作中亟需解决的问题。

血清学诊断技术是一项简便、快速、安全和经济的诊断方法，其中平板凝集试验[4]、血凝抑制试验(HI)[5]和酶联免疫吸附试验(ELISA)[6]等方法在现行的鸡传染性鼻炎防控中广泛应用，HI和ELISA方法已成为鸡传染性鼻炎诊断技术的行业标准[7]。然而，这些血清学诊断方法主要基于全菌蛋白等菌体来源的天然抗原，存在抗体效价与免疫保护率相关性不强的问题[8-9]，且检测步骤复杂，时间周期也较长。有报道指出，副鸡禽杆菌外膜蛋白HMTp210具有较好的免疫原性，可以作为亚单位疫苗的候选抗原[10]。并且，该蛋白作为诊断抗原所建立的ELISA检测方法具有较好的特异性和较高的灵敏度[10]。本试验以原核表达HMTp210部分蛋白P9[11]成分作为检测抗原，研制了一种副鸡禽杆菌抗体金标检测试纸条。

1 材料与方法

1.1 主要原辅材料 氯金酸、NC膜、样品垫、吸水滤纸及PVC板，均购自北京吉森生物科技有限公司。二喹啉甲酸 (bicinchoninic acid，BCA)法蛋白测定试剂盒，购自北京康为世纪生物科技有限公司。重组副鸡禽杆菌外膜蛋白(P9蛋白)由本实验室制备并纯化[11]。兔抗鸡IgG 蛋白由本实验室采用SPF鸡血清免疫雄性健康家兔后采血制备并纯化。羊抗兔IgG蛋白由本实验室采用健康家兔血清免疫山羊后采血制备并纯化。副鸡禽杆菌标准阳性对照血清为副鸡禽杆菌灭活疫苗(鼻多宝，信得科技，批号：201905001)免疫鸡血清，副鸡禽杆菌阴性对照血清为SPF鸡血清。鸡新城疫病毒阳性血清、禽流感病毒阳性血清、鸡支原体阳性血清、鸡大肠埃希菌阳性血清，由章振华研究员惠赠。

1.2 胶体金标记兔抗鸡IgG制备 通过心脏无菌采集SPF鸡血，37 ℃温箱放置30 min，在4 ℃冰箱中静置2 h，置于离心机中5 000 r/min离心10 min，收集约20 mL血清。辛酸-硫酸铵法纯化鸡血清IgG蛋白：首先血清水平离心5 000 r/min 约10 min，加入4倍体积醋酸钠溶液与离心后的上清部分混合均匀，加入0.1 mol/L 的NaOH溶液调整收集上清至pH 4.5左右。将25 μL辛酸滴加在每毫升混合液中，同时搅拌，置于4 ℃冰箱2 h后，水平离心8 000 r/min 约30 min，收集混合液的上清部分并进行过滤，调节至pH 7.4左右，加入0.277 g的硫酸铵与每毫升混合液混匀，搅拌30 min。混合液离心10 000 r/min 约15 min后收集混合液沉淀部分，过夜透析沉淀，得到粗提的IgG。鸡IgG浓缩步骤：装有IgG的透析袋用聚乙二醇包埋并透析2 h。BCA蛋白定量法测定蛋白含量为11.5 mg/mL，-20 ℃保存备用[12]。将鸡IgG与弗氏完全佐剂按1∶1体积比乳化后，接种4只雄性健康家兔颈部及背部皮下，每间隔10 d免疫1次，每次免疫0.5 mL，共免疫4次。免疫后通过心脏无菌采集兔血，分离血清后用辛酸-硫酸铵法纯化兔抗鸡IgG，方法同上。BCA蛋白定量法测定兔抗鸡IgG含量为15.5 mg/mL。用氯金酸制备浓度为0.01%的胶体金35 mL左右，用0.25 mol/L K2CO3调整胶体金溶液至pH 8.2左右，再加入兔抗鸡IgG约300 μg，匀速搅拌约20 min；再加入10% BSA 1.5 mL，均匀搅拌10 min；加入0.075 mL 20% PEG2000，均匀搅拌10 min；将标记好兔抗鸡IgG的胶体金颗粒于4 ℃冰箱静置1 h后放入50 mL离心管中，10 000 r/min水平离心35 min，垂直放置大约30 min后弃掉上清液，只留下浓缩标记好的胶体金颗粒备用。用0.2 mol/L PBS (pH 7.4)等量混匀标记好兔抗鸡IgG的胶体金颗粒，再加入0.5 g BSA定容至3 mL，混匀后置于4 ℃保存备用[13]。

1.3 羊抗兔IgG制备 按照无菌操作规范，通过心脏采集雄性健康家兔血，收集兔血清，IgG纯化方法同1.2，BCA蛋白定量法测定兔IgG含量为14.8 mg/mL。将弗氏完全佐剂与兔IgG按1∶1体积比乳化后，免疫1只雄性健康山羊的颈部皮肤及背部皮肤皮下多点注射乳化蛋白，每间隔10 d进行1次免疫剂量为1 mL的免疫，共进行3次免疫。第3次免疫后的第10天用无菌法采集羊的心脏血备用。用辛酸-硫酸铵法纯化羊抗兔IgG，纯化方法同1.2，-20 ℃保存备用[14]。

1.4 免疫层析检测试纸条的制备 将副鸡禽杆菌外膜蛋白P9和羊抗兔IgG蛋白用PBS溶液依次稀释成0.005、0.01、0.015 mg/mL和0.02 mg/mL。在PVC底板上粘贴好NC膜，再将稀释好的P9蛋白、羊抗兔IgG按顺序先后喷涂在NC膜，标为T线和C线，将试纸条置于37 ℃的温箱进行烘干。根据T线和C线颜色深度不随浓度增加而加深时，确定为最佳的喷涂浓度。再在玻璃纤维膜上用喷膜仪将标记好兔抗鸡IgG的胶体金溶液喷在对应位置，37 ℃温箱烘干，用划膜仪在NC膜上将0.01 mg/mL副鸡禽杆菌外膜蛋白P9和0.01 mg/mL的羊抗兔IgG蛋白分别喷涂，为试纸条的T线和C线，两线间距约0.5 cm左右，静置于37 ℃温箱内干燥2 h。将制备的样品垫、兔抗鸡IgG胶体金结合垫、NC膜和吸水垫按顺序粘贴在PVC板上，切成约0.4 cm条状，即为检测副鸡禽杆菌抗体的胶体金免疫层析试纸。将试纸装入铝箔袋中，加入干燥剂密封，4 ℃保存。

1.5 特异性试验 制备好的试纸条同时检测稀释100倍的鸡新城疫病毒的阳性血清、鸡支原体阳性血清、禽流感病毒阳性血清、鸡大肠埃希菌阳性血清。SPF鸡阴性血清作为阴性对照，副鸡禽杆菌灭活疫苗标准免疫血清作为阳性对照，观察几种样品的反应结果，判断所制备试纸条的特异性。检测方法：取10 μL血清或全血加入1 mL PBS中吹打混匀，吸取200 μL待检样品加入检测卡样品孔中(S孔)，静置，在15 min 内进行判读。阳性结果：C线与T线都有红色条带；阴性结果：C线有红色条带，T线无条带；无效结果：C线与T线均无条带。

1.6 灵敏性试验 用上述制备好的试纸条检测副鸡禽杆菌灭活疫苗标准免疫血清(按1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000稀释)，同时以标准阳性血清(未稀释)为阳性对照，出现阳性结果的血清最高稀释度即为试纸条的敏感度。检测方法同1.5。

1.7 稳定性试验 将上述制备好的试纸条与干燥剂一同装入铝箔袋中，密封保存于4 ℃冰箱，每隔7 d用PBS将副鸡禽杆菌亚单位疫苗标准阳性血清稀释100倍进行检测，共检测至28 d，检测方法同1.5。

1.8 临床样品检测 使用同一批次制备的试纸条对鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗免疫后的200份鸡血清样品进行检测，10 min后记录结果，检测方法同1.5。

1.9 与ELISA方法的比对 本实验室用副鸡禽杆菌外膜蛋白P9建立的间接ELISA方法[11]可以检测副鸡禽杆菌免疫或感染产生的抗体。采用ELISA方法与试纸条方法同时检测免疫血清200份，SPF鸡阴性血清20份，血清均按1∶100比例进行稀释，统计试纸条法与ELISA法检测结果是否一致。

2 结果

2.1 试纸条特异性 如图1所示，本试验制备的试纸条检测鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡支原体、鸡大肠埃希菌等的单因子血清均无可见条带，说明该试纸条特异性较好。

图1 试纸条特异性Fig.1 Strip specificity test从左至右：样品依次为鸡新城疫病毒阳性血清(ND)、禽流感病毒阳性血清(AI)、鸡支原体阳性血清(MG)、鸡大肠埃希菌阳性血清(E.coli)、SPF鸡血清(SPF)和副鸡禽杆菌阳性血清(Apg)From left to right: Samples were Newcastle disease virus positive serum(ND), Avian influenza virus positive serum(AI), Mycoplasma gallisepticum positive serum(MG), Escherichia coli positive serum(E.coli), SPF chicken serum(SPF) and Avian paragallinarum positive serum(Apg), respectively

2.2 试纸条灵敏性 如图2所示，本试验制备的试纸条检测不同稀释倍数的副鸡禽杆菌免疫血清，当稀释度为1∶1 000时检测线仍可见，表明该检测试纸条灵敏性良好，为保证检测的准确性，试纸条检测时样品稀释定为1∶100倍。

图2 试纸条灵敏性Fig.2 Strip sensitivity test从左至右：样品依次为副鸡禽杆菌高免血清稀释10、100、1 000倍和10 000倍以及标准阳性血清(对照)From left to right：Samples were Avibacterium paragallinarum hyperimmune serum diluted 10,100,1 000,10 000 times and standard positive serum(Control),respectively

2.3 试纸条稳定性 如图3所示，本试验制备的试纸条在4 ℃冰箱存放28 d，仍可以检测出标准阳性血清，说明该试纸条灵敏度及稳定性良好。

图3 试纸条稳定性Fig.3 Strip stability test从左至右：样品依次为试纸条放置7、14、21 d和28 d检测标准阳性血清(+)、阴性血清(-)(各1∶100倍稀释)From left to right:Samples were positive serum(+) and negative serum(-) (diluted 1∶100 times for each) detected after the strip was placed on 7,14,21 d and 28 d

2.4 临床样品检测 在200份免疫血清样品中，试纸条检测显示阳性结果的样品为196份，阴性结果的样品为4份，本试验制备的试纸条检测的符合率为98%。

2.5 与ELISA方法的比对 采用ELISA方法检测同一批鸡血清临床样品，结果全部为阳性。鉴于该批血清由试纸条法检测的阳性检出率是98%，可以算出以上2种检测方法的阳性符合率高达99%；用试纸条法和ELISA法检测SPF鸡阴性血清20份，结果显示试纸条法及ELISA法检测均为阴性，阴性符合率100%，结合阳性符合率，总符合率是99.5%。

3 讨论

胶体金免疫层析技术是20世纪末发展起来的一种新型体外诊断技术，其优点为：操作简便、检测迅速、特异性强，成为快速检测药物残留、抗体和激素水平等的首选。胶体金标记由于标记物制备简便，方法敏感、特异，不需要任何辅助仪器和试剂，且操作人员不用进行技术培训，方便于广大基层检验人员，检测结果判断清楚直观，用时短，可对大批量样品进行现场检测和大面积普查[15]。

本试纸条所用检测蛋白P9源自副鸡禽杆菌外膜蛋白HMTp210。该蛋白含有副鸡禽杆菌重要的保护性抗原[16]。Sakamoto等融合表达了不同血清型的HMTp210的高变区，用动物试验证明了该融合蛋白能够产生与全细菌灭活疫苗相似的保护水平[10]。该蛋白是亚单位疫苗的候选抗原成分，也是建立有效抗体检测方法的候选蛋白。本试验在已建立的ELISA方法[11]的基础上，用P9蛋白作为检测抗原，建立了一种间接免疫层析金标试纸条，该试纸条具有很高的特异性、灵敏度及稳定性，对阳性样品检测灵敏度可达1∶1 000，对疫苗免疫血清样品检测符合率为100%，放置28 d后仍可检测出稀释后的阳性血清。与间接ELISA法相比，试纸条法的敏感性稍弱，抗体水平较低的样品可能会出现阴性结果[17]。但试纸条的优点在于不需要专门的仪器设备，适用于田间现场快速检测，也可同时检测大量血清样本，可以作为免疫效果监测、疾病诊断等的技术手段[18-19]。本试验构建的副鸡禽杆菌抗体检测胶体金试纸是对HI[20]、ELISA等抗体检测方法的有益补充。

综上，基于重组外膜蛋白的副鸡禽杆菌抗体金标检测试纸具备较高的检测灵敏度和较好的特异性，结合其快速简便等操作特点，是一种较理想的副鸡禽杆菌抗体检测试剂。