新型鸭呼肠孤病毒山东株的分离鉴定及致病性分析

马 芹 ， 许明清 ， 汪建华 ， 赵 杰 ， 张中波 ， 石艳红 ， 李玉峰 ， 张秀美

(1. 山东和康源生物育种股份有限公司 ， 山东 济南 250102 ； 2.山东省农业科学院家禽研究所 ， 山东 济南 250031 ；3. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 ， 山东 济南 250100)

新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)感染最早发生在我国南方地区，北方较少报道[1-3]，自2015年开始，北方樱桃谷鸭的NDRV检出率明显增高[4-5]。近2年，NDRV在山东地区的樱桃谷鸭中广泛流行，主要引起雏鸭精神沉郁、食欲废绝，消瘦，跗关节肿胀、腿软等一些特征性的症状[6-8]，料肉比明显升高，剖检可见脾脏出血、坏死，机体免疫力下降，进而继发感染导致较高的死亡率[9]；同时关节肿胀、瘸腿现象较为严重，造成了较高的淘汰率，给养殖带来了巨大困扰。近日，山东菏泽樱桃谷部分鸭出现脾脏坏死、瘸腿症状，本课题组通过对8个鸭养殖区进行调研，了解到腿病主要发生于6～8周龄的雏鸭，并且发病鸭大多表现脾脏异常，据此初步怀疑与新型鸭呼肠孤病毒有关。本试验从病死鸭中采集肝脏、脾脏，进行病原的分离鉴定、纯化培养及致病性分析，探究新型鸭呼肠孤病毒是否为引发脾脏坏死、瘸腿症状的原因，以期为该病的综合防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料 山东菏泽地区商品肉鸭养殖场10日龄发病鸭。

1.2 试验用鸡胚、动物、细胞 7日龄SPF鸡胚，购自山东斯帕法斯公司；1日龄商品鸭、35周龄健康樱桃谷种鸭，均购自山东和康源生物育种股份有限公司；Vero细胞由本实验室提供。

1.3 主要仪器与试剂 PCR仪，购自伯乐生命医学产品有限公司；凝胶成像系统，购自北京赛智创业科技有限公司。RNA提取试剂盒，购自爱思进生物技术有限公司；RT-PCR反应试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 病料处理 无菌采集发病鸭的肝脏和脾脏，剪碎后按1∶3比例加入无菌PBS溶液，充分研磨制备组织悬液，反复冻融3次后8 000 r/min离心10 min，取上清液用于病毒核酸的提取，具体提取步骤参考试剂盒内说明书。

1.4.2 病原鉴定 根据GenBank 中登录的新型鸭呼肠孤病毒S1基因序列，利用Primer 5软件设计特异性鉴定引物，上游引物为5′-ACCTCAGGATATCGCTGAAACT-3′,下游引物为5′-CTCCATCCCTGCAGCACATGTAAAG-3′。RT-PCR扩增体系：2×Mix 12.5 μL，One-step Mix 1.25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，病毒RNA 2 μL，ddH2O 7.25 μL。扩增程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 20 s，72 ℃ 8 min，扩增结束后在凝胶成像系统下进行观察，胶回收后连接转化并进行测序分析。

1.4.3 病毒的分离培养 将1.4.1制备的组织悬液经0.22 μm滤器过滤后，接种于7日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种量为0.2 mL/只，胚体放置于37 ℃温箱内培养，每天观察胚体情况，弃去24 h内死亡鸡胚，收取24～144 h内死亡鸡胚的尿囊液及胚体，研磨后进行无菌试验验证和新型鸭呼肠孤病毒检测，同时检测是否具有鸭瘟病毒、坦布苏病毒、副黏病毒、鸭肝炎病毒、细小病毒等混合感染。分离毒在鸡胚传代稳定后，将收取的病毒液接种于Vero细胞，观察该病毒对Vero细胞的适应性。

1.4.4 动物回归试验 为探究该病毒对雏鸭的致病性，将80只1日龄樱桃谷鸭平均分成2个组，攻毒组颈部皮下注射病毒液0.5 mL/只(105.0ELD50/0.1 mL)，对照组颈部皮下注射同等剂量无菌PBS溶液，每天观察鸭只精神状态和死亡情况。于攻毒前和攻毒后第10天分别进行称重，比较体重变化情况；同时于攻毒后第5、7天和第10天进行剖检，每次每组剖检10只，观察脏器变化情况；剩余鸭只继续饲养至8周，观察腿病发生情况。

2 结果

2.1 病原鉴定 通过PCR扩增得到1 300 bp的特异性条带(图1)，与新型鸭呼肠孤病毒S1基因扩增片段大小相符。经测序和同源性分析，可知分离病毒株与新型鸭呼肠孤病毒代表毒株(TH11、091等代表毒株)同源性为94%～96%，与北京鸭呼肠孤病毒[4](KT861593)同源性为96.8%，与鹅呼肠孤病毒(Goose orthoreovirus，GRV)同源性为95%，与番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)同源性为49%～50%，与禽呼肠孤病毒(Avian orthoreovirus，ARV)同源性为44%～48%，利用MEGA软件建立进化树分析可知，分离病毒株与新型呼肠孤病毒和鹅源呼肠孤病毒亲缘关系较近，与MDRV、ARV处于不同分支(图2)，因此确定该分离病毒株为新型鸭呼肠孤病毒，毒株命名为HZDRV。

图1 S1基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of S1 geneM：Marker； 1：阴性对照； 2：阳性对照； 3：肝脏； 4：脾脏M:Marker; 1:Negative control; 2:Positive control; 3:Liver; 4:Spleen

图2 不同毒株S1基因序列的同源性分析Fig.2 Homology analysis of S1 gene sequences from different strains▲：本试验分离株▲:The strain isolated in this experiment

2.2 病毒的分离培养 组织悬液接种7日龄SPF鸡胚后，可导致胚体在72～96 h内集中死亡，胚体呈现水肿、严重出血(图3)。收取尿囊液和胚体进行RT-PCR扩增，结果显示，新型鸭呼肠孤病毒扩增阳性，鸭瘟病毒、坦布苏病毒、副黏病毒、鸭肝炎病毒、细小病毒扩增阴性(图4)，细菌检测阴性。病毒液接种Vero细胞后，细胞圆缩脱落，传至第5代时，观察到细胞拉网空泡化(图5)，因此该病毒在鸡胚和Vero细胞上均可增殖。

图3 NDRV分离毒株感染鸡胚病变Fig.3 Lesion of chick embryo infected with NDRV isolate 1：正常胚体； 2～3：死胚胚体1:Normal embryo body; 2-3:Dead embryo body

图4 RT-PCR检测结果Fig.4 RT-PCR detection resultM：Marker； 1：阳性对照； 2：阴性对照； 3：新型鸭呼肠孤病毒；4：细小病毒； 5：鸭肝炎病毒； 6：副黏病毒；7：坦布苏病毒； 8：鸭瘟病毒M:Marker; 1:Positive control; 2:Negative control; 3:Novel duck reovirus; 4:Parvovirus; 5:Duck hepatitis virus; 6:Paramyxovirus; 7:Tambus virus; 8:Duck plague virus

2.3 动物回归试验 雏鸭致病性试验结果显示：1日龄雏鸭攻毒后第5天死亡1只，剖检可见脾脏坏死，但尚未形成炎性膜；攻毒后第7天未出现雏鸭死亡，但剖检时可见坏死灶和炎性膜。攻毒后第10天仍未出现雏鸭死亡，但剖检发现脾脏坏死比例为10/10，对照组为0/10。称重结果显示，攻毒组平均体重为390 g，对照组平均体重为538 g，攻毒组体重明显低于对照组，两组相差38%。观察至第8周，攻毒组有5只出现瘸腿，瘸腿比例5/10，跗关节无明显变化，剖检可见膝关节及附近的肌肉有大量干酪样物、部分鸭股骨头坏死，结果见图6；对照组无腿病发生。

图5 病毒在Vero细胞上增殖Fig.5 Virus multiplication in Vero cellsA：对照； B：24 h； C：40 h； D:48 hA:Control; B:24 h; C:40 h; D:48 h

3 讨论

本试验从发生脾脏坏死的病死鸭中分离出病毒株，并用RT-PCR扩增、测序分析确认为新型鸭呼肠孤病毒，随后将分离到的病毒株接种于1日龄樱桃谷雏鸭，通过剖检观察到脾脏坏死、变硬，还观察到肝脏有坏死灶，证明新型鸭呼肠孤病毒可导致雏鸭的脾脏和肝脏坏死。据刘伟等[2]报道，感染鸭还可观察到心肌出血、肾脏和法氏囊出血，但在本试验中未观察到相应症状，可能是不同分离毒株在致病机理方面有所差异。攻毒鸭观察至第8周，50%左右的鸭出现瘸腿症状，主要剖检症状为肌腱肌肉处有大量黏液或干酪样物，与养殖现场第6～8周出现的腿病症状吻合，通过实验室的分离鉴定，在肌腱中分离到NDRV。鸭发生瘸腿的因素有很多，如鸭呼肠孤病毒、葡萄球菌、鸭沙门菌、链球菌感染及外伤等。葡萄球菌感染多发生在中鸭和成鸭，引起跗关节和趾关节肿胀变形，剖检观察到关节腔内有白色或淡黄色脓性分泌物或干酪样物，肌腱也肿胀变形。笼舍的金属尖锐处或地面的突出粗糙会造成鸭的外部伤口，若饲养环境处理不当，会继而引发细菌感染，严重者会引起瘸腿。所以对于腿部疾病病例，需要临床和实验室诊断技术相结合的方式进行鉴别诊断。目前，我国尚未研发出新型鸭呼肠孤病毒疫苗，根据现场情况，疫苗研制更加迫切，特别是活疫苗的研制和开发[10-11]，会给前期腿病防控带来新曙光。雏鸭脾脏坏死的防控可侧重母源抗体的保护，目前母源抗体或卵黄抗体对雏鸭的保护尚不明确，需要进一步研究。